【山茱萸多糖炮制前后的化学研究】 山茱萸的炮制方法是

　　摘 要：目的：对比炮制前后山茱萸多糖分子量和组成的变化，探讨炮制对其结构和组成的影响，阐述山茱萸多糖炮制增效的机理。方法：经脱脂、沸水提取，乙醇沉淀、Savage法脱蛋白得到粗多糖，再经DEAE-52阴离子交换树脂和Sephadex G-200葡聚糖凝胶柱色谱分离得到纯化的山茱萸精多糖（SZYS和SZYP），用红外光谱和紫外光谱分析其结构，凝胶色谱测定其相对分子量，HPLC测定其单糖组成。结果：分离得到了山茱萸多糖SZYS，其分子量为3.59×104，单糖组成为Glu∶Ara∶Rha=1∶1.51∶1.17；山茱萸多糖SZYP，分子量为1.16×104，单糖组成为Glu∶Ara∶Rha=1∶8.05∶1.78。结论：炮制前后山茱萸多糖分子量和单糖组成均发生变化，为山茱萸炮制增效的机理研究提供一定的依据。�
　　关键词：山茱萸；炮制；多糖；化学结构
　　中图分类号：R283.1文献标识码：A
　　文章编号：1673-7717(2008)05-0950-03�
　　Chemical Studies on Polysaccharide in Crude and Processed Fructus Corni
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　　DAI Yan�peng�1，2，DING Xia�1，3，FU Zi�qin�1，2，CAI Bao�chang�1，2�
　　(1.Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，Jiangsu,China;2.Jiangsu Key Laboratorry of Chinese �
　　Medicine Processing,Najing 210028,Jiangsu,China；3.Nanjing Agriculture University，Nanjing 210095,Jiangsu,China
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　　Abstract:Objective：Compare the changes of the molecular weight and composition of the polysaccharide in Fructus Corni before and after processing. Explore the effect of the processing to structure and composition of the polysaccharide. Describe the mechanism of polysaccharide which is better effective in processed Fructus Corni. Methods:Degreasing, hot water extraction,ethanol precipitation and column chromatography on DEAE-cellulose and Sephadex G-200 were used to isolate and purify the polysaccharides in Fructus Corni. IR and UV were used to analysis the structure of the two purified polysaccharide (SZYS and SZYP). HPGPC and HPLC were used to measure the mean molecular weight and monosaccharide components of the polysaccharides. Results:The molecular weight of polysaccharide SZYS is 3.59×104 and the monosaccharide components is Glu∶Ara∶Rha=1∶1.51∶1.17.The molecular weight of polysaccharide SZYP is1.16×104 and the monosaccharide composition is Glu∶Ara∶Rha=1∶8.05∶1.78. Conclusion:After processing,the monosaccharide composition and molecular weight of the polysaccharide both have changed. It could provide certain basis for the mechanism research of processed Fructus Corni that is more effective.
　　Keywords:Fructus Corni；processing；polysaccharide；chemical structure
　　
　　山茱萸(Fructus Corni)首见于《神农本草经》,为山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb. et Zucc.)的干燥果肉。味酸、涩、微温。入肝、肾经，生品以敛阴止汗力胜，酒蒸后可增强温补肝肾作用。山茱萸多糖具有明显的增强免疫功能及抗氧化性[1-2]。因此笔者对山茱萸生、制品多糖进行了一系列化学及药理试验，本实验对山茱萸生、制品多糖进行分离纯化，并测定相对分子量和单糖组成，对比两者之间的差别，为山茱萸炮制机理研究提供依据。�
　　
　　1仪器和材料
　　
　　Waters 515高效液相色谱仪（Waters公司，Waters 515 pump、Waters 717 Auto sampler）；Alltech 500 ELSD蒸发光散射检测器（Alltech）；Millennium 32工作站；TU-1800S紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。
　　DEAE-52纤维素（Whatman，上海斯高勒科贸有限公司），Sephadex G-200 (Pharmacia)，透析袋(MW：8000～14400，USA)，葡聚糖系列标准品：Dextran T-38、Dextran T-50、Dextran T-410、Dextran T-270、Dextran T-670、Dextran T-1400（USA，CHEM SERVICE），标准单糖：阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、鼠李糖、果糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸（中国药品生物制品鉴定所，南京赛吉科技有限公司），所用试剂均色谱纯和分析纯。
　　山茱萸药材购于河南西峡县山茱萸医药公司，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉；山茱萸酒制品（由南京中药饮片厂按2005版中华人民共和国药典加工制得）。�
　　
　　2实验方法�
　　
　　2.1山茱萸多糖的提取
　　山茱萸生、制品干燥果肉以95%乙醇回流脱脂，药渣干燥后以水(90～100℃)提取3次，合并提取液，浓缩，分级醇沉至20％、40％、60％、80％。取40％醇沉物加水溶解，H�2O�2法脱色，Savage法脱蛋白，透析，浓缩，80％醇沉，沉淀用无水乙醇，丙酮，乙醚洗涤，50℃真空干燥，得山茱萸生、制品40％粗多糖。�
　　2.2山茱萸多糖的纯化
　　称取DEAE-52纤维素100g，以400mL蒸馏水充分溶胀24h，减压抽干，水洗至中性，减压抽干，以1mol•L-1NaOH溶液浸泡1h，水洗至中性，以1mol•L-1HCl溶液浸泡1h后，水洗至中性，1mol•L-1 NaOH溶液浸泡1h后，水洗至中性，湿法装柱两根；将山茱萸生、制品40％粗多糖进行DEAE-52柱层析，分别以H�2O、0.1～2.0mol•L-1 NaCl洗脱，每10mL收集1管，苯酚硫酸法跟踪检测，绘制洗脱曲线（见图1），根据洗脱曲线合并单一峰，洗脱液减压浓缩，对水透析，冷冻干燥得山茱萸生、制品不同浓度NaCl洗脱的粗多糖。�
　　
　　经巨噬细胞体外实验表明，0.1mol•L-1和0.3mol•L-1NaCl洗脱的粗多糖均有增强巨噬细胞吞噬功能的作用，但0.1mol•L-1NaCl洗脱的生、制品粗多糖之间有显著性差异，而其他部分差异不大，故对0.1mol•L-1洗脱的部分进行进一步分离纯化。
　　取Sephadex G-200葡聚糖凝胶用适量蒸馏水浸泡12h,再以100℃溶胀4h后,抽气装柱,用0.1mol•L-1NaCl溶液平衡48h。取生、制品粗多糖0.1mol•L-1NaCl溶解上样，0.1mol•L-1NaCl洗脱，每5mL收集一管，苯酚硫酸法跟踪检测，合并，洗脱液减压浓缩，对水透析，冷冻干燥得精多糖SZYS和SZYP。�
　　2.3纯度及分子量测定�
　　2.3.1标准曲线及含量测定
　　采用硫酸-苯酚法测定绘制葡萄糖标准曲线，葡萄糖溶液2mL加5％纯化苯酚1mL，混匀后加浓硫酸7mL，沸水浴20min，冰水浴至室温，482nm处测定吸光度（A），同标准曲线法测定精多糖SZYS和SZYP吸光度，以标准曲线计算多糖含量。�
　　2.3.2紫外光谱扫描
　　分别取精多糖少量SZYS和SZYP溶于蒸馏水中，在波长200～800nm进行紫外扫描。�
　　2.3.3 葡聚糖柱层析
　　将精多糖SZYS和SZYP以前述步骤进行Sephadex G-200葡聚糖凝胶柱色谱层析,绘制洗脱曲线。�
　　2.3.4多糖分子量测定
　　分别称取SZYS和SZYP多糖2mg，溶于1mL磷酸盐缓冲液（pH=7.8~8.0）中，高速离心10min，上清液HPLC。
　　色谱条件：色谱柱：TSK-GEL G4000PWXL(7.8mm×30.0cm)，TSK guard column PWXL(6.0mm×4.0cm)，两柱串联；流动相：0.1mol•L-1 pH=8.0磷酸盐缓冲液；流速：0.4mL•min-1；检测器：RID-6A refractive index detector；柱温：40℃；进样量：100μL。�
　　2.4红外光谱扫描
　　分别称取精多糖SZYS和SZYP少许，KBr晶体压片,4000～400cm�-1扫描。�
　　2.5单糖组成分析
　　精密称取SZYS和SZYP多糖各10mg，加2mol•L-1的三氟乙酸2mL，装入安瓿瓶中，封口，110℃水解8h，挥去水解液，用1mL流动相溶解，15000r/min高速离心15min，上清液HPLC分析。
　　色谱条件：
　　色谱柱：Kromasil-NH�2(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈∶水(75∶25)；流速：0.8mL•min-1；
　　柱温：30℃；漂移管温度：95℃；气流速度：2.1L•min-1；进样量：10μL。�
　　
　　3实验结果�
　　
　　3.1理化性质
　　山茱萸多糖SZYS和SZYP均为白色粉末，水中溶解度较小，易溶于NaCl溶液，不易溶于有机溶剂。�
　　3.2 多糖纯度及分子量测定
　　根据葡萄糖标准曲线,测得精多糖SZYS和SZYP的质量分数分别为98.76%和99.04%。两者在200～800nm紫外扫描图谱显示为末端吸收，280、260nm处无紫外吸收，表明多糖中无蛋白、多肽及核酸。Sephadex G-200洗脱曲线为单一对称峰，表明山茱萸精多糖SZYS和SZYP为均质多糖，见图2。�
　　
　　以logMW为纵坐标，保留时间TR为横坐标，绘制logMW-TR校正曲线，Y＝－0.1257x＋10.077，R�2＝0.9929。
　　由logMW-TR校正曲线求得SZYS的相对分子量分别为3.59×104，SZYP的相对分子量为1.16×104。�
　　
　　3.3红外扫描
　　SZYS多糖特征吸收峰为3500～3100cm-1(O-H)，1672cm-1(C=O)，1401cm-1(C-H)，1200~950cm-1有一组弱吸收峰；SZYP多糖特征吸收峰为3200cm-1(O-H)，1605cm-1(C=O)，1408cm-1(C-H)，1200~950cm-1(C-O-C，O-H)有一组较强的吸收峰。IR图谱(见图3)表明SZYS多糖与SZYP多糖结构存在差异。�
　　3.4单糖组成
　　从山茱萸中分离得到的精多糖SZYS和SZYP经HPLC分析，其单糖组成均为葡萄糖、阿拉伯糖和鼠李糖，其摩尔比分别为：Glu∶Ara∶Rha=1∶1.51∶1.17和Glu∶Ara∶Rha=1∶8.05∶1.78。�
　　
　　4 讨 论
　　
　　药效学研究结果表明，炮制后山茱萸40％醇沉物能有效延长肾阴虚小鼠耐缺氧时间，提高SOD活力、降低MDA含量，能有效起到滋阴补肾、抗氧化作用，与生品有显著性差异，但20％醇沉物硫酸苯酚液紫外扫描基本无吸收，且炮制后40％醇沉物增加很多，故本实验对山茱萸炮制前后40％醇沉部分进行研究。
　　在山茱萸生、制品40％醇沉物中分离得到了药理活性有差异的两种均质多糖，两者的单糖组成种类相同，但比例不同，炮制后葡萄糖的比例下降，其他两种均相对升高，同时制品多糖相对分子量较生品小，推测可能是在蒸制过程中多糖发生断裂，脱掉小分子糖链或单糖，这亦可能是山茱萸炮制后药理作用发生变化的原因。脱掉的单糖在蒸制过程中会转化为5-羟甲基糠醛，有较强的药理作用[3－5]，另文报道。�
　　
　　参考文献�
　　［1］ 苗明三，方晓燕，杨云，等.山茱萸多糖免疫兴奋作用的研究［J］.河南中医，2005，22（5）：24.�
　　［2］ 李平，王艳辉，马润宇.水提山茱萸多糖的理化性质及抗氧化活性研究［J］.食品科学，2003，24（7）：133.�
　　［3］ Hideale Matsuda, Yasuyuke Tsukioka, Kenzo Moriyama,et al.Studies on Rehmanniae Radix.V.5-Hydroxymethyl-2-furaidehude,Active Constituent of the Steamed Root of Rehmannia glutinosa Having Increasing Activity of Erythrocyte Deformability in Rats［J］.Natural Medicines，2004，58（1）：34-37.�
　　［4］ Hou YC,Ching H,Chao PD,et al.Effects of glucose,frutose and 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde on the presystemic metabolism and absorption of glycyrrhizin in rabbits［J］. J Pharm Pharmacol，2005，57（2）：47-25.�
　　［5］ 耿放，王喜军.5-羟甲基-2-糠醛（5-HMF）在中药复方中研究现状及相关药效探讨[J].世界科学技术-中医药现代化，2005，7（6）：52-56.