HPLC指纹图谱【清开灵注射液指纹图谱的ＨＰＬＣ研究】
时间：2019-01-26 04:51:17 来源：达达文档网 本文已影响 人 
摘要：目的：建立清开灵注射液的HPLC指纹图谱。方法：选择NUDEOSIL-C18色谱柱(4．6mm×250mm，5μm)，流动相(A)甲醇-(B)0．5％醋酸梯度洗脱，运行时间65min，检测波长255nm，测定清开灵注射液的指纹图谱。结果：标示出清开灵注射液17个共有峰，以黄芩苷作为参照峰，得出共有峰的相对保留时间和相对峰面积，其非共有峰面积未超过总峰面积的10％。结论：方法准确、重复性好，为清开灵注射液的指纹图谱质量控制提供了依据。
关键词：清开灵注射液；指纹图谱；HPLC
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)04-0868-03
清开灵注射液由安宫牛黄丸经拆方而来，它由黄芩苷、栀子、金银花、水牛角等7味中药提取制成，具有清热解毒、化痰通络、醒神开窍的作用，用于热病神昏，中风偏瘫，神志不清等症。清开灵注射液中成分复杂，靠少数指标成分的含量测定不能全面控制质量。笔者根据中药注射剂指纹图谱研究的技术要求［1］，采用梯度洗脱法对清开灵注射液的指纹图谱进行了研究，为清开灵注射液的质量控制提供有效方法。
1仪器与试剂
1．1仪器
岛津LC-10A系列高效液相色谱仪(含LC-10ATVP泵LC-10Ai泵，SPD-M10AVP检测器，CTO-10A柱温箱，Class-vp工作站)。
1．2试剂和样品
甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。黄芩苷对照品购自中国药品生物制品检定所，清开灵注射液由某厂家提供的10个不同的批号，批号030304、030311、030407、030422、030425、03090l、030920、030922、031011、031019。
2方法与结果
2．1样品的制备
清开灵注射液适量，用50％甲醇稀释，并通过0．45μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液；取黄芩苷对照品适量，加50％甲醇溶解，制成含黄芩苷100μg／mL的溶液，作为对照品溶液。
2．2色谱条件及分析方法
色谱柱：NUDEOSIL-C18色谱柱(4．6mm×25mm，5μm)；流动相：(A)甲醇-(B)0．5％醋酸，梯度洗脱：0min：10％甲醇，50min：100％甲醇，65min：100％甲醇；检测波长：255nm；流速：1．0mL•min-1；柱温：40℃，进样量20μL。
2．3方法学考察
2．3．1精密度试验取同一批号供试品溶液，连续进样67次，结果表明，指纹图谱中各共有峰相对保留时间和峰面积基本一致，其相似度均大于95％，符合指纹图谱研究技术的要求。
2．3．2稳定性实验取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，12，24h检测，结果表明，指纹图谱中各共有峰相对保留时间和峰面积基本一致，其相似度均大于95％，符合指纹图谱研究技术的要求。
2．3．3重复性试验取同一批号供试品6份，按2．1项下制备供试品溶液，分别进样检测，结果表明，指纹图谱中各共有峰相对保留时间和峰面积基本一致，其相似度均大于95％，符合指纹图谱研究技术的要求。
2．3．4样品测定取10批清开灵注射液，分别按供试品的制备方法制供各试液并检测，并用中药指纹图谱相似度计算软件进行了分析，以黄芩苷的色谱峰为参照物峰，其相对保留时间为41．9min。标示了清开灵注射液中17个共有峰，见图1，相对保留时间和相对峰面积见表1，相似度见图2。
3讨论
3．1色谱条件的选择
色谱柱的选择：本实验比较了二个不同厂家的色谱柱，NUDEOSIL-C18柱(250mm×4．6mm，5μm)，PHENOMENEX-C18柱(250mm×4．6mm，5μm)，SINOCHROM ODS(200mm×4．6mm，5μm)，SINOCHROM ODS色谱柱的柱效较差，大多数峰不能分开，NUDEOSIL-C18柱和PHENOMENEX-C18柱的分离情况相近，综合考虑，选用NUDEOSIL-C18柱作为本实验的色谱柱。
流动相的选择：本实验先采用了等度洗脱，发现用强洗脱能力的流动相时，出峰时间很早，且峰不能很好的分开，再用弱洗脱能力的流动相时，出峰少，且山峰时间太迟；故采用梯度洗脱，分别使用了乙腈-水，乙腈-0．5％磷酸，乙腈-0．5％醋酸，甲醇-水，甲醇-0．5％磷酸，甲醇-0．5％醋酸作用流动相进行线性梯度洗脱，发现用洗脱能力较弱的甲醇时峰的分离情况较乙腈好，在水相中加入磷酸或醋酸后，出峰明显增多，峰形有较大的改善，而用醋酸时的基线较磷酸时平直，综合考虑，选用甲醇-0．5％醋酸线性梯度作为本实验的流动相。检测波长的选择：本实验设定检测器从200nm～360nm波长范围内进行测定，在低波段230nm以下时，色谱图的基线有较明显的飘移，而270nm以上时色谱峰明显的减少，故本实验选用了255nm作为指纹图谱的检测波长。
柱温的选择：实验发现柱温在30℃以下时，内标物黄芩苷色谱峰与后面成分峰重叠，且45min的3个峰无法分离；故本实验选择柱温为40℃，使上述问题得以改善。
3．2指纹图谱的相似度比较
利用中药指纹图谱相似度计算软件，以10批清开灵注射液的指纹图谱综合平均作为对照模板，计算10批样品的相似度，均大于0．99，说明此厂家清开灵注射液的质量稳定。另外，用软件判断具有客观性，减少人为误差，也减少了按以前指纹图谱统计方法来统计的工作量，值得推广。
3．3文献报道［2］
用高效液相色谱／蒸发光散射检测器建立了复方清开灵注射液的指纹图谱，为清开灵注射液的质量控制提供了一种较合理、简便的方法模式，但是ELSD的灵敏度较低，只检测到为数不多的色谱峰，且受样品组分挥发性的影响；用中药指纹图谱监控中药质量，并不要求指纹图谱中的每一个组分都很清楚，也不要求对每一个组分都精确测定，但要求图谱具有指纹特征，即要求专属、稳定、实用［1］；笔者用高效液相紫外检测器测定，共得到17个共有峰，且分离较好，可全面反映中药复杂的化学成分及其相对比例，在有些有效成分尚未阐明的现状下，仍可有效的表征中药质量。
4展望［3-4］
中药指纹图谱研究一般分为两个阶段，在初级阶段，针对中药注射剂这一相对简单的体系，充分利用指纹图谱这一现代科学技术手段表征中药注射剂的特性，表达成品的质量，以达到对工艺操作和原药材的质控；通过对大量注射剂的指纹图谱研究，建立系统的测定方法和全面的指标控制参数，寻找一定的数学模型，最终达到指纹图谱的可操作、可控、稳定、显性和量化的目的，提高整个中药注射剂的质量控制水平，并以此抛砖引玉，逐步建立其它类中药制剂、中药复方制剂的指纹图谱。
在对中药指纹图谱的研究进行到一定阶段，得到相对完备的指纹性数据，相对合理的数学模型后，指纹图谱的研究就进入研究的高级阶段，即指纹特征和药效相关性研究，指纹图谱的生物等效性的研究。这也就是多维多息化学特征谱的研究。所谓多维，是采用多种分析仪器联用的模式，所得的多维指纹图谱；所谓多息，是指中药的特征谱应努力做到包括化学和药效两方面的信息，化学信息即上面提到的多维图谱，可采用有效部位采解决包含药效信息这个问题。这样得到的中药多维多息特征谱，包括了体现药效信息的多个有效部位的各种指纹图谱，进一步解决了中药制剂整体性和复杂性的难题。
当然，药效相关的指纹图谱质量标准最能反映中成药质量，但由于中药的复杂性，中药中活性成分多，目前的技术水平还不能将中药中所有的成分都研究清楚，再加上指纹图谱质量控制技术的许多方面还有待完善，在这种情况下，要求制订与药效相关的指纹图谱似乎为时过早。但如果以指纹图谱来控制工艺的稳定性、确保不同批次产品质量的稳定一致则切实可行，在生产上具有现实意义。
参考文献
［1］国家药品监督管理局.关于印发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》的通知［S］．中成药，2000，22(10)：671-675.
［2］曹进，徐燕，张永知，等．清开灵注射液HPLC／ELSD指纹图谱建立及质量相关性研究［J］．分析化学，2004，32(4)：469．473．
［3］倪力军，张立车，李鹏．对中药指纹图谱研究现状及应用的思考［J］．天然产物研究与开发，2002，14(5)：60-64．
［4］罗国安，王义明．中药指纹图谱的分类和发展［J］．中国新药杂志，2002，11(1)：46-51．
