益肾活血胶囊对高同型半胱氨酸血症及动脉粥样硬化兔TGF-β1mRNA和蛋白表达的影响:大唐活血胶囊48粒价格

　　摘要：目的 探讨益肾活血胶囊对高同型半胱氨酸（Hcy）血症致动脉粥样硬化（AS）兔转化生长因子-β1（TGF-β1）表达的影响。方法 48只新西兰兔，随机平分为正常组、模型组，益肾活血胶囊小剂量组、中剂量组、大剂量组及西药（叶酸、维生素B6、维生素B12）组，除正常组外，其他组建立高Hcy血症及AS动物模型，分别给予相应的药物治疗，观察血浆Hcy浓度、腹主动脉血管形态学变化及TGF-β1mRNA和蛋白表达。结果 益肾活血胶囊和叶酸等维生素均可明显降低血浆Hcy水平，减轻血管内膜厚度，下调腹主动脉TGF-β1mRNA和蛋白表达，益肾活血胶囊大剂量组疗效最佳。结论 益肾活血胶囊可明显降低血浆Hcy水平，抑制Hcy诱导的动脉粥样硬化形成，其机制可能与抑制TGF-β1表达有关。
　　关键词：益肾活血胶囊；同型半胱氨酸；动脉粥样硬化；转化生长因子-β1
　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349（2011）07-0832-03
　　
　　Effect of Yishen Huoxue Capsule on TGF-β1 mRNA and Protein Expression in Hyperhomocysteine-induced Atherosclerosis in Rabbits
　　Liu Fenye，Zhang Jidong
　　Department of Traditional Chinese Medicine，Shandong Provincial Hospital，Shandong University（Jinan 250021）
　　Abstract：Objective To explore the effect of Yishen Huoxue capsule （YHC） on transformation growth factor-β1（TGF-β1） mRNA and protein expression in hyperhomocysteine（Hcy）-induced atherosclerosis in rabbits.Methods Forty-eight male New Zealand white rabbits were divided into six groups：Control group，model group，low dose YHC group，middle dose YHC group，high dose YHC group and western medicine group （folic acid，vitamin B6 and vitamin B12）.Apart from control group，the rabbits in other groups underwent balloon catheter injury and high methionine diet to induce hyperhomocysteinemia and atherosclerosis （AS），followed by treatment with different drugs.Plasma Hcy concentration，the aortic morphological changes，TGF-β1 mRNA and protein expression were examined by high performance liquid chromatography，haematoxylin-eosin （HE） staining，real-time quantitative PCR and immunohistochemistry，respectively.Results Both YHC and western medicine could decrease the plasma Hcy concentration，attenuate the intimal thickening，down-regulate TGF-β1 mRNA and protein expression.The efficacy of high dose YHC group was superior to low dose YHC group，middle dose YHC group and western medicine.Conclusion YHC could decrease the plasma Hcy level and subsequently reverses the aortic lesion induced by Hcy.The mechanisms may be related to its suppressive effect on TGF-β1 expression.
　　Key words：Yishen Huoxue capsule；hyperhomocysteine；therosclerosis；transformation growth factor-β1
　　
　　动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病、心肌梗死、原发性高血压、脑卒中、血管成形术后再狭窄等发生发展的病理生理基础。高同型半胱氨酸（Hcy）血症是AS的独立危险因素［1,2］。益肾活血胶囊可明显降低血浆Hcy水平，改善冠心病患者的临床症状［3］。转化生长因子-β1（TGF-β1）在AS及血管成形术后再狭窄中具有重要的作用。本研究以高蛋氨酸饮食诱导兔高Hcy血症及AS动物模型，探讨益肾活血胶囊对TGF-β1基因与蛋白表达的影响。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验动物与药物 雄性纯种新西兰大白兔48只，体质量2.0 kg～2.5 kg，购自山东省农业科学院。益肾活血胶囊由枸杞子、丹参、生黄芪、黄精、川芎、水蛭、瓜蒌皮、大黄、黄连等药物组成。
　　1.2 主要试剂 Hcy购自Sigma公司；Trizol、Oligo dT和dNTP 反转录酶购自Invitrogen公司；M-MLV 购自Promega公司；荧光实时定量PCR（real-time PCR） 试剂盒（SYBR Premix Ex Taq TM） 购自Takara 公司；兔抗TGF-β1多克隆抗体购自Boster公司；山羊抗兔IgG抗体购自北京中山生物技术有限公司。
　　1.3 方法
　　1.3.1 分组及给药 随机从48只新西兰兔中选取8只为正常对照组，给予普通饲料喂养。其余40只随机平分为5组：模型组，益肾活血胶囊小剂量组、中剂量组、大剂量组，西药组，均以球囊损伤腹主动脉内膜联合2%蛋氨酸饲料喂养20周，制备高Hcy及AS模型。其中药物治疗组在实验12周后，高蛋氨酸饲料继续喂养的同时，给予下列不同处理8周。小剂量组给予益肾活血胶囊260 mg/kg 灌胃，1 次/日；中剂量组给予益肾活血胶囊780 mg/kg 灌胃，1 次/日；大剂量组给予益肾活血胶囊1 300 mg/kg，1 次/日；西药组：给予联合用药叶酸0.49 mg/kg、维生素B122.47μg/kg、维生素B6 0.49 mg/kg，1 次/日。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　1.3.2 血浆Hcy测定 实验结束时每只动物采血2 mL，EDTA-Na2 抗凝，30 min 内4 ℃3 000 r/ min离心15 min，分离血浆，-80 ℃冻存，以高效液相色谱法检测血浆Hcy浓度。
　　1.3.3 腹主动脉形态学观察 末次给药后24 h禁食，不禁水，3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉。快速打开腹腔剥离腹主动脉，剪取约0.5 cm腹主动脉，10%中性甲醛固定，苏木素-伊红染色。用Image-Pro Plus 5.0图像分析系统检测管壁平均内膜厚度（IT）、中膜厚度（MT）、内膜面积（IA）、内膜与中膜面积比（IA/MA）。
　　1.3.4 总RNA提取及cDNA 合成 取约1 cm 冻存的腹主动脉，按Trizol 试剂说明书提取组织总RNA，用紫外分光光度仪测OD260/ OD280，所有标本值在1.7～2.0。用Oligo dT、dNTP 和M-MLV 在PCR热循环仪上将RNA 反转录为cDNA ，反应条件为42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。
　　1.3.5 实时荧光定量PCR检测TGF-β1mRNA表达 兔TGF-β1与内参基因GAPDH 引物由上海博亚公司（BioAsia ） 合成,引物序列为:TGF-β1（132 bp） 上游5"- GACCTGGGCTGGAAGTGG -3"，下游5"- CGGGTTGTGCTGGTTGTA -3 ";GAPDH（180bp），上游5"- CATCATCCCTGCCTCCACT-3"，下游5"- GCCTGCTTCACCACCTTCTT-3"。反应体系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL,SYBR Green I 10 μL，加水至20 μL。反应条件： 95 ℃预变性10 s ；59.5 ℃（TGF-β1） 或64 ℃（GAPDH） 退火5 s；72 ℃延伸10 s，共45个循环，最后40 ℃ 30 s结束反应。采用2－ΔΔCt方法对TGF-β1 mRNA 表达进行相对定量分析。
　　1.3.6 免疫组化检测腹主动脉壁TGF-β1蛋白表达 3%H2O2室温孵育10min，PBS洗2 min×3次。滴加10%正常羊血清封闭液，室温孵育20 min，甩干。滴加兔抗人、TGF-β1多克隆抗体（1∶50稀释）。滴加生物素化山羊抗兔IgG。DAB 镜下显色，以PBS 代替一抗做阴性对照。
　　1.3.7 统计学处理 实验数据以均数±标准差（x±s）表示，组间差异采用one-way ANOVA分析和检验。采用SPSS 10.0 进行统计处理。
　　2 结 果
　　2.1 血浆Hcy 浓度变化（见表1） 与正常组相比，模型组兔血浆Hcy浓度明显升高（P6、维生素B12治疗，Hcy浓度均明显降低，与模型组相比差异有统计学意义（P1 mRNA表达（见表3） 与正常对照组相比，模型组兔血管壁TGF-β1 mRNA表达升高（P1 mRNA下降（P1 蛋白表达 与正常组相比，模型组兔血管壁TGF-β1蛋白表达显著升高（P1蛋白表达较模型组明显下降（P［4,5］。血浆Hcy水平与冠状动脉粥样硬化病变支数、病变严重程度及冠心病病死率呈正相关［6,7］。降低血浆Hcy水平及逆转由此而产生的病理变化成为近年来AS防治的热点。叶酸、维生素B6和维生素B12是同型半胱氨酸代谢的重要辅因子，是临床常用的治疗高Hcy血症药物。本研究以此为阳性对照，通过观察用药后血浆Hcy及动脉壁TGF-β1 基因及蛋白表达的变化，探讨益肾活血胶囊降低血浆Hcy水平及抗AS 的作用机制。
　　研究发现TGF-β1基因在兔动脉粥样斑块、高血压大鼠血管平滑肌细胞、人再狭窄血管均高表达［8,9］，而且TGF-β1表达的增高程度与AS病变呈正相关［10］。TGF-β1促AS、再狭窄形成的机制与促进血管内膜增生［11］、平滑肌细胞增殖及细胞外基质积聚有关［12］。本研究发现，与正常对照组相比，高Hcy血症及动脉粥样硬化兔血管壁TGF-β1表达显著升高，提示TGF-β1可能参与了Hcy致AS的病理过程。
　　血浆Hcy水平升高与肾虚、痰浊、血瘀密切相关，肾虚为发病之本，瘀血痰浊是重要的病理表现。益肾活血胶囊以补肾活血，祛痰清热为组方原则，方中枸杞子、黄精、黄芪补肾填精，丹参、川芎、水蛭、大黄活血化瘀，黄连、瓜蒌皮清热祛痰宽胸。可明显降低冠心病患者和高Hcy血症大鼠的血浆Hcy水平，具有改善内皮功能、抗氧化、抗凝作用［13,14］。本研究结果表明，益肾活血胶囊可明显降低血浆Hcy水平，抑制AS形成，其机制可能与下调TGF-β1的表达有关，且疗效优于叶酸等维生素。
　　参考文献：
　　［1］ Duell PB,Malinow MR.Homocyst（e）ine:An important risk factor for atherosclerosis vascular disease［J］.Curr Opin Lipidol,1997,8（1）:28-34.
　　［2］ Eikelboom JW,Lonn E,Genest J,et al.Homocyst（e）ine and cardiovascular disease:A critical review of the epidemiologic evidence［J］.Ann Intern Med,1999,131（5）:363-375.
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　［3］ 张继东,罗玮敏,杨瑞雪,等.益肾活血胶囊治疗冠心病高同型半胱氨酸血症的临床研究［J］.南京中医药大学学报,2005,21（5）:277-280.
　　［4］ Welch GN,Loscalzo J.Homocysteine and atherothrombosis［J］.N Engl J Med,1998,338（15）:1042-1050.
　　［5］ Lee HY,Chae IH,Kim HS,et al.Differential effects of homocysteine on porcine endothelial and vascular smooth muscle cells［J］.J Cardiovasc Pharmacol,2002,39（5）:643-651.
　　［6］ 许海燕,陈在嘉,扬跃进,等.冠心病患者血浆同型半胱氨酸水平变化的临床特点［J］.中国循环杂志,2001,6（3）:188-189.
　　［7］ Nygard O,Nordrehaug JE,Refsum H,et al.Plasma homocysteine levels and mortality in patients with coronary artery disease［J］.N Engl J Med,1997,337（4）:230-236.
　　［8］ 汤乃梅,孙士勇,柯碧波,等.转化生长因子β基因在某些心血管疾病中的表达［J］.生物化学杂志,1994，10（1）:30-33.
　　［9］ Nikol S,Isner JM,Pickering JG,et al.Expression of transforming growth factor-beta 1 is increased in human vascular restenosis lesions［J］.J Clin Invest,1992,90（4）:1582-1592.
　　［10］ 刘生祥,杨金娟,陈树兰.转化生长因子β1与冠心病关系的探讨［J］.宁夏医学院学报,1999，21（6）:391-392.
　　［11］ Wolf YG,Rasmussen LM,Ruoslahti E.Antibodies against transforming growth factor-beta 1 suppress intimal hyperplasia in a rat model［J］.J Clin Invest,1994,93（3）:1172-1178.
　　［12］ Janat MF,Liau G.Transforming growth factor-beta 1 is a powerful modulator of platelet-derived growth factor action in vascular smooth muscle cells［J］.J Cell Physiol，1992，150（2）:232-242.
　　［13］ 杨瑞雪,张继东,罗玮敏,等.益肾活血胶囊对同型半胱氨酸血症实验大鼠的影响［J］.山东大学学报（医学版）,2006,44（1）:98-101.
　　［14］ 杨瑞雪,张继东,罗玮敏,等.益肾活血胶囊对不稳定型心绞痛患者Hcy及ET、TNF-α、NO的影响［J］.上海中医药杂志，2006，40（1）:22-24.
　　作者简介:刘粉叶（1978―），女，毕业于山东大学医学院，主治医师，医学博士，现工作于山东省立医院（邮编：250021）；张继东，工作于山东大学齐鲁医院。
　　（收稿日期：2011-04-20）
　　（本文编辑 郭怀印）
　　
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文