黄丹凝胶抗炎及免疫抑制作用的实验研究 阿达帕林凝胶的副作用

　　摘 要：目的:观察黄丹凝胶的抗炎及免疫抑制作用。方法：以2,4一二硝基氯苯(DNCB)诱发的小鼠迟发型超敏反应作为细胞免疫炎症动物模型，以二甲苯诱发的小鼠耳廊肿胀炎症作为急性炎症动物模型，以寻常痤疮的常见致病菌为实验菌种，以黄丹凝胶为治疗药物，进行抗炎及免疫抑制作用实验研究。结果：黄丹凝胶能有效抑制DNCB致小鼠迟发型超敏反应及二甲苯致小鼠耳廊肿胀的炎症反应，能明显降低外周脾脏T淋巴细胞亚群(主要是CD4�＋)及免疫器官脏器指数，能明显抑致病菌种的生长。结论：黄丹凝胶具有确切的抗炎作用，能在一定程度上抑制细胞免疫及致病菌种生长。�
　　关键词：炎症；黄丹凝胶；免疫功能
　　中图分类号：R285.5文献标识码：A
　　文章编号：1673-7717(2008)05-1007-03��
　　Experimental Study on Anti-inflammation and Immunosuppression of Huangdan Pigmentum
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　　QI lin,LIU Li�fang�
　　(The First Affiliated Hostp ital of Hunan TCM College,Changsha 410007,Hunan,China
　　)�
　　Abstract:Objective:Experimental Study on the Anti- inflammation and Immunosuppression of Huangdan Pigmentum.Methods:To 2,4-Nitrochlorobenzene (DNCB) delayed-type hypersensitivity induced mice as animal model of Delayed Hypersensitivity. To xylene-induced mouse ear swelling of inflammation as a animal models of acute inflammation. to Bacteria Spectrum of Acne vulgaris as Experimental strain. Huangdan pigmentum for the treatment of a drug, inhibited the anti-inflammatory and immune Experimental Study.Results: Huangdan pigmentum can effectively inhibit DNCB induced delayed-type hypersensitivity and xylene-induced mouse ear swelling gallery of inflammatory response, can significantly reduce the spleen peripheral T-lymphocyte subsets (mainly CD�+�4) and immune organs organ index, could significantly restrain the growth of pathogenic bacteria.Conclusion:Huangdan pigmentum anti-inflammatory gel with the exact role to a certain extent, immune cells and inhibit bacteria growth.
　　Keywords:inflammation;Huangdan pigmentum;Immunological Function
　　
　　寻常痤疮是一种毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病，临床以粉刺、丘疹、脓疱、结节、囊肿等多种损害为特征。据报道100%的男孩和90%的女性在青春期会发生不同程度的痤疮[1]。本病的年平均就诊率占全皮肤科门诊的11.5%。并且发病率有逐年增高的趋势[2]。寻常痤疮多发于颜面，严重影响美容，给患者的求职、交友、生活带来极大的思想压力。痤疮的治疗一直是皮肤科的热门课题之一，医学界进行了大量研究，但由于西药副作用大且易于复发，疗效不能肯定。近10年来，研究者日益将目光投向中医药，力求在传统医药中寻求突破。内服汤药效果虽好，但由于过于繁琐且疗程较长，患者往往不能坚持。因此如何选用一种使用方便且患者易于接受的药物剂型成为一个亟待解决的问题。黄丹凝胶为传统的中药与现代制剂工艺结合，精心研制出的凝胶剂型，发挥了中医药特色，经皮给药提高了中药的利用度，期临床运用取得较好疗效。探讨该方治疗寻常座疮的作用机理，进行了抗炎免疫抑制作用实验，现报道如下。�
　　
　　1实验材料�
　　
　　1.1 实验动物及菌种
　　昆明种健康雄性小鼠，体重（20±2）g，共80只，由湖南中医药大学动物实验中心提供，合格证号：20－004。金黄色葡萄球菌(S.aureas质控菌株编号：26031)、表皮葡萄球菌（S.pepldernidis质控菌株编号：44156）、白色念珠菌(Monilia albican质控菌株编号：44136) 以上3种菌株由湖南中医药大学微生物教研室提供。痤疮丙酸杆（P.anes编号：NCTC737）购于复旦大学医学院病源生物公司。 �
　　1.2 实验药物及培养基
　　 2,4-二硝基氯苯(DNCB)：山西省芮城远东福利化工有限公司，批号2003-12-01。将DNCB适量加入1∶1体积比丙酮甘油分别配制成1%，0.5%浓度的溶液备用。二甲苯：武汉川西制氨厂，批号030304。地塞米松软膏：黄石海格尔药业有限公司，批号42022430。邦力痤疮王（0.3％维胺脂乳膏）：重庆华邦药业有限公司，批号:20041005。0.9%氯化钠注射：西安京西双鹤药业有限公司生产,批号：031119481。普通琼脂培养基：蛋白胨5.0g,牛肉膏2.6g,湖南中医药大学中医学院生化免疫实验室配制。改良GAM培养基：主要成分蛋白胨5.0g,牛肉膏2.6g，酵母粉5g,硫乙醇酸钠0.03％，磷酸二氢钠0.25％，中南大学湘雅医学院微生物教研室提供。沙保氏琼脂培养基：4%葡萄糖，1.0%蛋白胨，湖南中医药大学生化免疫实验室配制。黄丹凝胶（40mL/瓶）（大黄60g，丹参60g，百部20g，白花蛇舌草20g，天花粉20g，白芷20g，冰片2g。取丹参、百部、白花蛇舌草、天花粉、白芷5味中药，加8倍水煎熬2次，每次1h，加大黄后再煎30min，合并煎液过滤减压浓缩成300mL，用乙醇处理提取2次，冷藏放置，过滤成30g膏状物。另取卡波姆适量纯化水溶解，将冰片置研钵中研细与加热溶解的羟苯乙酯溶液共溶于上述药膏中，然后加到已溶涨好的卡波姆中再加入甘油，丙二醇搅匀，加纯水至全量，搅匀置冰箱备用）：湖南中医药大学第一附属医院制剂室提供，批号:20040310。�
　　1.3仪器BS110S型S电子天平（精度0.1）：北京赛多利斯天平有限公司生产。高速离心机LD5-2A型：北京医用离心机厂制造。A620微量荧光检测器（525）：中山医科大学达安基因诊断中心研制。�
　　1.4 试剂
　　抗小鼠L3T4、LYT2单克隆抗体及荧光抗体均购自武汉晶赛生物科技有限公司。�
　　
　　2实验方法�
　　
　　2.12,4-二硝基氯苯(DNCB)诱发的小鼠迟发型超敏实验�
　　2.1.1分组 实验小鼠随机分为4组，每组10只：黄丹凝胶组，地塞米松软膏组，生理盐水组，正常对照组。�
　　2.1.2方法 除正常对照组外，其它3组于实验前1天用10%硫化钠在小鼠腹部固定部位3cm×1cm面积脱毛，温水洗净。实验第1、2天（致敏期）于小鼠腹部脱毛部位涂1%DNCB，每天1次，每次20μL，第3、4、5天不涂药。第6天（诱发期）于小鼠左耳背涂20μL 0.5%DNCB诱发皮炎，右耳背涂1∶1丙酮甘油20μL作对照，正常对照组不作任何处理。
　　除正常对照组外，其它3组自第1次涂DNCB前2h开始于两耳处涂相应药物（软膏20μL/只，生理盐水0.3mL/只），每日3次，连续用药5天（第1、2、3、4、5天），第6天于诱发前2h及诱发后4h各涂药1次。正常对照组不作任何处理。�
　　2.1.3 耳重量 与诱发后24h后断头处死小鼠，剪下双耳，用直径0.6cm的打孔器在左右耳中部相同位置打下组织块，电子天平称重。计算两耳重量之差，作为炎症反应强度的指标。�
　　2.1.4 免疫器官脏器指数 处死小鼠后，取出每只小鼠的胸腺、脾脏，用电子天平称重，求出脏器指数（脏器重量 mg/10g体重）。�
　　2.1.5 脾脏T淋巴细胞亚群CD4 CD8荧光值 采用间接免疫荧光法。取小鼠脾脏，立即匀浆；常规方法制备淋巴细胞悬液（1.5×106/mL）；取100μL细胞悬液至40孔板中，离心2000r/min×10min，弃上清；将稀释好的抗小鼠L3T4及LYT2单克隆抗体各100μL分别加入对应孔内，空白对照孔不加单抗；4℃反应30min后，离心2000r/min×10min，弃上清，连洗3次；加入稀释好的荧光抗体各孔100μL，混匀后放4℃，30min，取出反应板，离心2000r/min×10min，弃上清，重复洗3次；加入50μL Hanks液，充分振荡后，置0.2mL EP管中，用DA620微量荧光检测器测定（525nm）各孔荧光值，用对照孔调定零点。�
　　2.2二甲苯诱发的小鼠耳廊肿胀的急性炎症实验�
　　2.2.1 分组 取实验小鼠，随机分为4组，每组10只；黄丹凝胶组，地塞米松软膏组，生理盐水组，正常对照组。2.2.2 方法 4组小鼠实验前同条件饲养5天（第1、2、3、4、5天），第6天除正常对照组外，其它3组每只小鼠左耳背涂20μL二甲苯致炎，右耳不予任何处理，在致炎前4h、后2h于左耳，各涂相应药物（软膏20μL/只，生理盐水0.3mL/只），1次，正常对照组不作任何处理。�
　　2.2.3 耳片重量 于致炎后3h洗净左耳，干燥后，处死小鼠，剪下双耳，用直径0.6cm的打孔器左右耳中部相同位置打下组织块，电子天平称重。计算两耳片重量之差，作为炎症反应强度的指标。�
　　2.3 黄丹凝胶的体外抑菌实验
　　采用平板扩散法，无菌肉汤琼脂培养基15mL注入无菌平皿，冷凝后，每平皿接种0.1mL菌液，于37℃作用10min后，用直径6mm打孔器在琼脂平板中打孔，孔间距、孔与平板边缘都要均匀。用移液器在每个孔中分别加入生理盐水、邦力痤疮王、黄丹凝胶各50μL, 37℃培养24h后，观察抑菌圈的有无及大小(白色念珠菌用沙保氏培养基，28℃培养48h后观察结果，痤疮丙酸杆菌用改良GAM培养基，37℃厌氧培养38h后观察结果)。�
　　3统计方法�
　　组间比较用t检验,两组率比较用χ�2检验,等级资料用秩和检验、Ridit分析。�
　　
　　4 结 果�
　　
　　4.1 黄丹凝胶对小鼠迟发型超敏反应（耳片重量)的影响
　　见表1。�
　　
　　4.2 黄丹凝胶对小鼠迟发型超敏反应免疫器官及脾脏T细胞亚群的影响
　　见表2。
　　
　　
　　5讨 论�
　　
　　中医有关痤疮的记载很多。临床实践认为本病病机除古人总结的肺热、血热、风热外同时与血瘀、湿热、痰核、胃肠实热、热毒蕴结、冲任不调有密切关系。黄丹凝胶为纯中药制剂，主要成分为大黄、丹参、百部、白芷、白花蛇舌草、天花粉，全方具有清热解毒、消肿散结、凉血活血的功效。方中大黄味苦，入肺、胃、大肠经是疮疡外科的常用清热解毒药。丹参性寒凉，入肺、胃经，兼有清热解毒与凉血活血的双重功效。二者共为方中君药，配伍使用增强了“清热解毒、消痈散结”的作用。百部甘、润入肺经，外用有杀虫止痒之功效。白芷性温，具活血散结之效，与大量寒凉药相伍，兼佐制之功。白花蛇舌草苦寒清解疮毒，并祛风湿治湿疮。天花粉性凉味甘，入肺经，该药能入血分，解血分热毒，与白芷配伍有消肿散结的作用。此外黄丹凝胶以水溶性新型敷料氮酮为基质，制得具有水溶性特点的透明凝胶剂，制备时加入甘油作为润湿剂,可使凝胶更细腻，均匀，冰片清凉芳香同时也有较强的促渗作用。该剂型克服了传统膏药易阻塞皮脂腺分泌及酊剂刺激性大的缺点,发挥了中医外治特色且经皮给药提高了中药的利用度。�
　　该方局部治疗机理研究，主要围绕痤疮发病的3个关键环节进行探讨。（1）抑制毛囊皮脂腺单位微生物生长。对寻常痤疮粉刺与脓疱两种细菌分离研究结果显示，细菌的分离均以痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌为最多，其中痤疮丙酸杆菌是主要的致病细菌[3]。黄略[4]对48味中药物抑制痤疮丙酸杆菌作用研究显示，丹参、大黄、黄芩、虎杖、连翘等8味中药对痤疮丙酸杆菌高度敏感，黄柏、地榆、川芎、当归等12味对痤疮丙酸杆菌中度敏感。这20味中药中15种属清热药，3种属于活血药，其作用颇为符合中医对痤疮清热活血的治则。（2）抑制皮脂腺分泌。周华[5]发现痤疮患者皮脂腺分泌率明显高于正常人2倍，并且皮脂腺分泌率高低和痤疮的病情成正比。进一步研究表明痤疮患者皮脂腺分泌率过高与外周雄激素代谢亢进有关，推测患者皮脂腺细胞内雄激素代谢酶活性升高，导致睾酮向双氢睾酮的转化增多，且双氢睾酮更易与雄激素受体结合，刺激皮脂腺增生，使痤疮患者皮脂分泌过多。丹参酮是中药丹参的脂溶性有效成分，动物实验证明其具有抗雄激素作用。白花蛇舌草，天花粉具有抑制皮脂腺分泌的作用[6]。（3）抗炎免疫。现代抗炎免疫研究证明了以痤疮丙酸杆菌为中心的免疫学机制，包括体液免疫和细胞免疫均参与了痤疮的病理过程，并和痤疮的炎症密切相关。对一些中药免疫药理学实验证明，丹参对小鼠足垫DTH及T淋巴细胞转化率均有抑制作用，表明丹参水溶性有效成分丹参素对细胞免疫有抑制作用。清热解毒中药大黄的有效成分大黄素，在体内外条件下均可抑制炎性介质白三烯B4的生物合成，是花生四烯酸脂酶抑制剂[7]。�
　　目前对该病的研究多侧重于临床疗效的观察，而对其药物作用机理的实验研究相对缺乏，本实验从免疫炎症的角度探讨了该方的疗效机制，并将细菌学方法引入实验中，综合分析和评价了该方的治疗效果和作用机制，比单纯的临床研究更为可靠。以期为临床应用提供科学依据，为以后治疗寻常痤疮药物的研究和开发提供了新的思路。�
　　参考文献�
　　［1］ 高惠荣.美国最新临床医学问答―皮肤病学［J］.北京：海洋出版社，2000：195.�
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