宁镇1号大豆子叶节植株再生体系的建立
时间：2021-01-17 22:07:53 来源：达达文档网 本文已影响 人 
黄丽燕 顾安乐 周玉丽
摘 要：选用宁镇1号大豆子叶节作为外植体进行离体再生，研究外植体消毒时间、不同激素浓度对大豆子叶节再生的影响。结果表明：宁镇1号大豆用0.1% HgCl2消毒最适时间为12～16min，不定芽诱导最适的6-BA和TDZ浓度分别为2.0mg/L和0.1mg/L，最适的6-BA和TDZ组合浓度为6-BA 1.00mg/L和TDZ 0.05mg/L，最适合生根的IBA浓度为0.4mg/L。
关键词：大豆种子;子叶节;不定芽;再生体系
中圖分类号 S565.1文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）15-0021-03
Abstracts：
Ningzhen NO.1 soybean was used as explant for regeneration and the effect of different disinfection time and different concentrations of hormone on the cotyledon node regeneration of soybean were studied. The results showed that the most suitable time of disinfection by 0.1% HgCl2 is between 12 to 16 minutes， and the most suitable concentration of 6-BA and TDZ for regenerating adventitious shoots is 2.0mg/L and 0.1mg/L， the concentration of the combination of the two is 6-BA 1mg/L and TDZ 0.05mg/L， and the best concentration of IBA for rooting is 0.4mg/L.
Key words：
Soybean seed; Cotyledonary node; Adventitious bud; Regeneration system
大豆是重要的油料及粮食作物，是食用油和植物蛋白的主要来源之一。将优良外源基因导入大豆中将对今后的大豆育种和加工生产起到积极的推动作用，并能有效提升大豆的营养和经济利用价值[1]。但是大豆转基因的关键问题就是遗传转化效率极低，只有0.3%～0.9%，而且受基因型影响较大。
建立高效稳定的大豆再生体系是大豆遗传转化的先决条件[1]。至今人们已从大豆子叶[2]、子叶节[3]、胚尖[4]、上胚轴[5]、茎尖[6]、未成熟种子的子叶[7]及茎尖[8]等方面对不定芽器官发生再生系统进行了研究，发现子叶节具有取材不受季节限制、诱导率高、成苗快、变异风险较低、遗传稳定性好等优点[9]，被认为是目前用于大豆遗传转化较为理想的外植体[10-11]。
本试验以项目组现筛选出的宁镇1号大豆品种为材料，从种子消毒、不定芽诱导、不定芽生根等方面对宁镇1号大豆子叶节植株再生体系的建立进行了初步研究，旨在为建立大豆遗传转化体系提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 供试材料 大豆品种：宁镇1号。
1.2 试验方法
1.2.1 无菌苗的获得 挑选籽粒饱满且无病虫害的宁镇1号大豆种子，先用自来水冲洗干净，在超净工作台中操作以下步骤：用75%的乙醇消毒30s，无菌水冲洗2～3次，再在0.1%的升汞溶液中浸泡消毒，升汞消毒时间分别为0、2、4、8、12、16min，用无菌水冲洗3～4次。将消毒后的种子种脐向下接种于萌发培养基中，每个消毒时间处理接种20瓶。在26℃、每日光照16h的条件下培养，5d后记录并清理污染瓶数。种子萌发培养基采用1/2MS B5（MS培养基大量元素减半，有机成分为B5）+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH5.8。
1.2.2 不定芽的诱导 在大豆种子萌发、长出子叶且子叶尚未展开时取出，去除种皮，将子叶横向切去1/2，保留3～5mm下胚轴，再纵切分离2片子叶，切除顶芽、叶腋以及子叶边缘一部分，接种于不定芽诱导培养基中。不定芽诱导采用2种处理的培养基，均以1/2MS B5为基本培养基，一种是6-BA和TDZ单独作为培养基，共设7个浓度，每个浓度条件下接种11瓶，每瓶5个外植体;另一种是6-BA和TDZ组合作培养基，共设12个浓度，每个浓度条件下接种7瓶，每瓶5个外植体（见表2）。定时清理污染瓶，接种21d后统计不定芽数量。不定芽诱导率指发生不定芽的外植体占接种未污染的外植体总数的百分比。
1.2.3 不定芽的伸长 接种28d后，将外植体上的不定芽切下并转移至不定芽伸长培养基中进行培养。采用1/2MS B5+0.5mg/L 6-BA+0.05m/L IBA+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L作为不定芽伸长培养基。
1.2.4 生根 将长至2～3cm的不定芽接种于IBA浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8mg/L IBA培养基中进行生根培养。基本培养基仍采用1/2MS B5+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，每个浓度下接种5瓶，每瓶2个不定芽。及时清理污染瓶，记录每组未污染的生根数，比较IBA对不定芽生根的影响。
2 结果与分析
2.1 不同消毒时间对大豆种子消毒效果的影响 种子消毒是获得大豆子叶节再生苗的第1步，也是关键一步。排除试验操作染菌的情况，对大豆种子污染率进行统计，发现随着升汞消毒时间的延长，污染率呈下降趋势（见图1），说明用0.1%HgCl2对宁镇1号大豆种子进行消毒的最佳时间为12～16min。
2.2 不同浓度6-BA和TDZ对大豆子叶节不定芽诱导的影响 表1为分别使用不同浓度6-BA和TDZ时宁镇1号大豆子叶节的诱导率情况。由表1可知：宁镇1号大豆子叶节不定芽诱导率随6-BA浓度的增加呈先升后降的趋势，当6-BA浓度为2.0mg/L时诱导率达到最大值，为10.0%;随着TDZ浓度的增加，宁镇1号大豆不定芽诱导率逐渐降低，当TDZ浓度为0.1mg/L时诱导率最高，为22.5%。
2.3 不同浓度6-BA和TDZ组合对大豆子叶节不定芽诱导的影响 表2为宁镇1号大豆在不同6-BA和TDZ组合浓度下不定芽诱导率的变化情况。由表2可知：在不加入6-BA的情况下，不定芽诱导率随TDZ浓度的升高而升高，当TDZ浓度为0.10mg/L时诱导率为16.7%;将6-BA浓度保持为1.0mg/L不变，随着TDZ浓度的升高，子叶节诱导率呈先升高后降低的趋势，当6-BA浓度为1.0mg/L、TDZ浓度为0.05mg/L时宁镇1号大豆的子叶节诱导率达到最高值33.0%;增大6-BA濃度至2.0mg/L，随着TDZ浓度的增加，子叶节诱导率先升高后降低，TDZ浓度为0.05mg/L时诱导率较大，为15.0%;当6-BA浓度增长至4.0mg/L时，在不同TDZ浓度下，宁镇1号大豆不定芽诱导率普遍不高，可能是由于6-BA浓度过大，抑制了大豆子叶节分化成苗。由此可知，1.0mg/L 6-BA+0.05mg/L TDZ组合最适合宁镇1号大豆子叶节不定芽的诱导。
2.4 不同IBA浓度对大豆子叶节再生植株生根的影响 当再生植株生长至2～3cm时，将其转移至1/2MS B5附加不同浓度的IBA的生根培养基中进行生根培养。由表3可知，不同浓度IBA对宁镇1号大豆子叶节诱导苗生根率的影响差异并不十分显著，但对生长状况有影响。随着IBA浓度的增高，生根率呈先升高后降低的趋势，当IBA浓度为0.4mg/L时生根率最高（37.5%），且根的生长状况较好;随着IBA浓度继续增大，其生根率又呈现下降趋势，但根的生长状况较好。因此，宁镇1号子叶节最适合的生根培养基为1/2MS B5+IBA 0.4mg/L。
3 结论与讨论
不同基因型大豆子叶节再生植株需要的条件不同，因此须通过试验来探索其再生植株体系。根据大豆再生植株培养过程各阶段的情况，更换不同配方的培养基，诱导产生不定芽、生根。根据不同基因型大豆在培养过程中需要的各种条件，确定不同大豆所适合的再生植株体系。
赖冰冰等[1]以“辽豆17”、“辽豆18”和“辽豆23”等大豆品种的子叶节为外植体诱导不定芽的发生，得出当向1/2MS B5培养基中添加0.05mg/L IBA和4.0mg/L 6-BA时不定芽的诱导率最高、1/2MS B5+0.5mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA是适宜的不定芽伸长培养基、1/2MS B5+1.0mg/L IBA是适宜的生根培养基等结论;曹荣等[3]以“小粒黄”大豆子叶节为外植体进行研究，结果表明：附加不同浓度6-BA和TDZ的1/2MS B5基本培养基上均能诱导出丛生芽，丛生芽诱导率在1.5mg/L 6-BA和0.2mg/L TDZ配比时达到最高（85.7%）;寇坤等[12]对大豆新品系黑农56子叶节进行了组织培养研究，确定黑农56最适的芽诱导培养基为2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA的B5培养基。
本试验基于前人研究加以改进，选用宁镇1号品种，以大豆子叶节为材料，探索其再生植株体系（图2）。结果表明：宁镇1号大豆种子用0.1%升汞消毒最合适的时间为12～16min，其子叶节诱导不定芽的最适宜激素配比为1.00mg/L 6-BA+0.05mg/L TDZ，生根最适合的IBA浓度为0.4mg/L。
试验过程中，宁镇1号大豆的子叶节诱导率及生根率都较低，且子叶节诱导不定芽最适的激素浓度也与前人研究结果不尽相同，诱导成功率总体不高。这可能是受大豆基因型影响，说明不同基因型大豆子叶节再生所需要的各种激素不同，这也是转基因大豆较难获得成功的原因之一。
参考文献
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（责编：徐世红）
