H9亚型禽流感SPF鸡发病模型的构建
时间：2021-01-22 18:05:09 来源：达达文档网 本文已影响 人 
周萌 李颖 林树乾 李桂明 杨世发 黄中利 宋敏训 傅剑 殷斌 刘月月 赵增成
摘要：为了构建理想的H9亚型禽流感病毒（AIV）SPF鸡发病模型，对不同日龄SPF鸡、不同感染方法进行了预试验，最后选用SPF青年蛋鸡为试验动物，采用AIV H9N2毒株与大肠杆菌强毒株、IBV M41株各0.5 mL联合滴鼻感染的方法，进行了发病模型构建。结果表明，试验鸡发病症状明显、病变典型，这为进一步完成H9亚型禽流感防治药物的临床疗效评价奠定了基础。
关键词：禽流感;发病模型;人工感染
中图分类号：S855.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2020）05-0117-04
Abstract To construct an ideal H9 subtype avian influenza virus （AIV） incidence model of SPF chicken， the pretest was carried out with different day-old SPF chickens by different infection methods. And then， the young laying SPF hens were selected as experimental animals， and the AIV H9N2 strains were combined with 0.5 mL Escherichia coli virulent strain and 0.5 mL IBV M41 strain for intranasal infection. The results showed that the symptoms of the tested chickens were obvious and the lesions were typical. The construction of this animal model laid the foundation for further evaluation on clinical efficacy of H9 subtype avian influenza prevention and treatment drugs.
Keywords Avian influenza; Animal model;Artificial infection
禽流感（AI）是由A型流感病毒（AIV）感染引起的嚴重危害养禽业的一种急性传染性疾病[1]，给养禽业带来了巨大的经济损失。生物安全和免疫接种是目前主要的防控手段。但由于AIV易于变异、亚型众多、各亚型间交叉免疫保护力弱，导致免疫失败的现象屡屡发生，为该病的免疫预防带来了困难[2-4]。研制防治禽流感的有效药物，对控制禽流感意义重大。在新兽药的研发中，成功构建出理想的发病模型，对科学评价新兽药的临床疗效具有至关重要的作用。在以往的研究中，禽流感发病模型的构建常存在以下困难：采用低致病性的H9亚型AIV对SPF鸡攻毒时，发病症状非常轻微，临床上表现不出明显的症状;采用高致病性H5亚型AIV攻毒时，由于毒力过强，发病鸡几乎100%死亡。以上两种情况，都不利于对药物药效做出正确的评价，严重制约了禽流感防治药物的研发[5]。H9亚型禽流感在临床发病上，通常具有与大肠杆菌、传染性支气管炎等混合感染的特点，因而表现出较严重的发病症状[6，7]。本研究依据以上特点，采用不同日龄试验动物、不同攻毒剂量、不同感染途径，采用混合感染的方式，对H9亚型禽流感人工发病模型的构建进行了研究，最终确定了一种症状明显、具有特征性病变的人工发病模型构建方法，可用于禽流感防治药物的临床试验研究。
1 材料与方法
1.1 毒株
H9亚型（H9N2）AIV株，EID50为每0.1 mL 10-6.83;传染性支气管炎病毒（IBV） M41株，EID50为每0.1 mL 10-6.50;禽源大肠杆菌c84008株。均由山东省农业科学院家禽研究所保存。
1.2 试验动物
35日龄SPF雏鸡，130 日龄SPF青年蛋鸡。
1.3 试验方法
1.3.1 雏鸡感染预试验35日龄SPF雏鸡，共分为4组，每组6只。一组，每只雏鸡肌注H9N2 AIV液0.3 mL，同时肌注大肠杆菌新鲜培养物0.1 mL;二组，每只鸡滴鼻接种H9N2 AIV液0.3 mL;三组，每只鸡肌注H9N2 AIV液0.3 mL;四组，每只鸡肌注大肠杆菌新鲜培养物0.1 mL。攻毒后，每天观察各组雏鸡发病症状及死亡情况，最后剖检各只雏鸡病理变化。
1.3.2 青年蛋鸡感染预试验130日龄SPF青年蛋鸡，共分为4组，每组4只。第一组，每只鸡用H9N2 AIV液滴鼻0.5 mL;第二组，每只鸡用H9N2 AIV液和IBV M41株液各滴鼻0.5 mL;第三组，每只鸡用H9N2 AIV液和大肠杆菌新鲜培养液各滴鼻0.5 mL;第四组，每只鸡用H9N2 AIV液、大肠杆菌液、IBV M41株液各滴鼻0.5 mL。攻毒后，每天观察各组青年蛋鸡发病症状及死亡情况，最后剖检记录病理变化。
1.3.3 发病模型的正式构建 （1）确定攻毒方法：在预试验的基础上，根据不同日龄、不同感染方法所表现的结果，确定正式的模型构建方法：130日龄SPF青年蛋鸡，共8只，每只鸡先滴鼻H9N2 AIV液0.5 mL，所有鸡滴完后，再滴IBV M41株液0.5 mL，滴完后再每只鸡滴鼻大肠杆菌液0.5 mL。
（2）临床症状及病理变化观察：攻毒后，每天观察鸡群临床症状及死亡情况，并做好记录。
（3）称重：试验开始和结束时，每只鸡称重，计算增重率。
（4）体温测定：攻毒后24 h开始，每天用体温计测量体温。
（5）抗体测定：试验结束时，每只鸡采血，分离血清，采用微量凝集法[8]测定H9N2 AIV抗体水平。
（6）排毒测定：攻毒后24 h开始，用棉拭子每只鸡泄殖腔采集样本，将采样后的棉拭子放入2 mL离心管中，加入500 μL生理盐水，在旋涡混合器上振荡1 min，置冷冻离心机10 000 r/min离心5～10 min，取上清200 μL，TRIZol法提取RNA[9]。再用RT-PCR法检测H9亚型AIV。根据公开发表的H9N2禽流感病毒全基因组序列，设计HA基因的扩增引物，其中上游引物P1：5，片段大小490 bp。RT-PCR按一步法进行，采用20 μL反应体系：2×one step Mix 10 μL，one step Enzyme mix 1 μL，引物P1（10 μmol/L）0.5 μL，引物P2（10 μmol/L）0.5 μL，模板RNA 3 μL， Rnase free ddH2O 补至20 μL。反应程序：50℃反转录30 min;94℃ 预变性3 min;
94℃变性20 s，50℃退火20 s，72℃延伸30 s，进行30个循环;72℃终延伸5 min。RT-PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测[10]。
2 结果与分析
2.1 雏鸡预试验结果
试验结果（表1）表明，雏鸡同时肌注H9N2 AIV和大肠杆菌，比单独肌注H9N2 AIV或大肠杆菌时临床症状更严重;单独接种H9N2 AIV，雏鸡不表现任何症状。H9N2 AIV肌肉注射或滴鼻，雏鸡表现无明显差异。
2.2 青年蛋鸡预试验结果
各试验组均有发病症状，但均无死亡。单独感染H9N2 AIV时症状轻微，混合感染IBV或大肠杆菌时，症状明显加重。三种病原同时混合感染时，症状最为严重，剖检后病理变化最为明显（表2）。表明，采用130日龄SPF青年蛋鸡攻毒，与雏鸡相比，发病症状更加典型;H9N2 AIV与IBV、大肠杆菌同时混合感染，症状及病变更为典型，更适合发病模型的构建。
2.3 人工感染模型正式试验的构建结果
2.3.1 臨床症状及病理变化攻毒后48 h内，鸡群无任何异常。48 h后，出现明显的临床症状，禽流感症状典型，病鸡出现“呼噜呼噜”的湿性啰音，有的鸡出现尖叫声，许多鸡缩头、乍毛、精神不振。攻毒后第3天死亡1只。
病鸡剖检：最典型的变化，卵泡充血、出血、坏死、液化，输卵管内有大量脓性或干酪样分泌物，腺胃乳头或乳头间有轻微出血，盲肠扁桃体肿胀出血，个别鸡心脏出血，气管轻微充血。
2.3.2 体重变化攻毒后第10天与攻毒前相比，体重明显下降（表3）。
2.3.3 体温情况试验鸡攻毒前测定正常体温为41.2℃，攻毒后均出现了发热症状（表4）。
2.3.4 抗体测定结果 攻毒后第11天试验结束时每只鸡采血，测定H9N2 AIV抗体水平，平均HI抗体滴度为7.5。
2.3.5 排毒测定结果攻毒后从第2天至第6天，均可从泄殖腔拭子中检测到目的条带，尤其是3～5天时阳性率最高，表明攻毒后试验鸡具有排毒现象。攻毒后不同天数，鸡群阳性率情况见表5，第4天的PCR检测结果见图1。
3 讨论与结论
3.1 为了构建H9亚型禽流感人工发病模型，对不同日龄SPF鸡、不同攻毒剂量、不同感染途径、不同混合感染方式进行了试验筛选，最终确定了最佳的模型构建方法：选用130日龄新开产的SPF青年蛋鸡，采用H9N2亚型AIV与IBV M41株、大肠杆菌强毒株混合感染，每只鸡各滴鼻0.5 mL。在此条件下，感染鸡表现出了明显的发热、精神萎靡、咳喘症状，剖检病鸡具有H9N2亚型禽流感的特征病变，攻毒后11天HI抗体滴度达7.5，感染后3天泄殖腔拭子H9N2 AIV RT-PCR检测阳性率达87.5%。表明，本方法构建的H9亚型禽流感人工感染发病模型，具有发病症状明显、病变典型、发病率高、死亡率适宜、稳定可靠的特点，这为进一步开展禽流感药物防治研究奠定了重要的基础。
3.2 疾病动物模型是医学研究和医药产业发展不可或缺的支撑条件，缺乏合适的动物疾病模型已成为疫病机理研究、药物筛选评价、疫苗开发的重要瓶颈[11-13]。构建科学稳定的动物发病模型是药效评价的基础，往往是新兽药研发中开展实验性临床试验的难点，在新兽药研发中具有重要作用[14]。动物试验因为受到毒株毒力、攻毒剂量、外界环境、家禽日龄、家禽自身抵抗力等多种因素的影响，需要大量试验寻求最佳的动物感染模型，并保证很好的重现性和稳定性，才能对药效做出客观的评价[15，16]。本方法构建的禽流感发病模型发病症状明显、病鸡死亡率不高，对加快研发新型禽流感防治药物具有重要意义。
3.3 在兽医临床上，鸡群中H9亚型禽流感自然发病时，常常与大肠杆菌、IBV、支原体等发生混合感染[17，18]，从而对养禽业造成重大损失。本试验发病模型的构建，采用了混合感染的方法，更加符合鸡群自然发病的特点。
3.4 从日龄来看，青年蛋鸡攻毒后发病症状和剖检变化比雏鸡更具有特征性，尤其是蛋鸡卵巢与输卵管的病变更具特征性，因而选择青年蛋鸡进行发病模型构建更为理想。
3.5 以前我们曾经单独用大肠杆菌强毒株，采用滴鼻法，进行过SPF鸡攻毒试验，结果鸡只无任何临床症状，因而本次试验未再设置单纯大肠杆菌滴鼻对照组。我们也曾进行过单独IBV攻毒试验，采用120日龄SPF鸡，单独用IBV M41株每只0.5 mL滴鼻，48 h后感染鸡仅出现轻微的呼吸道症状，剖检腺胃、肌胃、肠道、心脏、卵巢、输卵管等内脏器官均无明显出血病变。因此，本次试验没有另设IBV单一攻毒对照组。
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