益胃煎剂对萎缩性胃炎小鼠Bcl-2、Bax蛋白表达的影响
时间：2021-04-23 07:53:27 来源：达达文档网 本文已影响 人 
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【摘要】 目的：观察益胃煎剂对慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）小鼠胃黏膜病理组织学及凋亡行为的影响。方法：小白鼠60只随机分为正常对照组、CAG模型组（模型组）、益胃煎剂干预组（干预组）。水杨酸钠法复查萎缩性胃炎小鼠模型，观察胃黏膜病理形态学变化;应用免疫组织化学法观察胃黏膜细胞Bcl-2、Bax的表达情况。结果：对正常对照组、模型组、益胃煎剂干预组的慢性炎症程度进行比较，干预组与正常对照组无显著差异，而模型组慢性炎症程度高于正常对照组、干预组。干预组与正常对照组的Bcl-2 LI比较差异无统计学意义（P>0.05），而模型组的Bcl-2 LI明显高于正常对照组与干预组（P<0.01）。干预组与正常对照组的Bax LI比较差异无统计学意义（P>0.05），而模型组的Bax LI明显低于正常对照组与干预组（P<0.01）。干预组与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），而模型组的Bcl-2/Bax比值明显高于正常对照组与干预组（P<0.01）。结论：益胃煎剂可以减轻CAG小鼠胃黏膜炎症程度，其机制可能与其能够下调Bcl-2表达，上调Bax表达，从而调节胃黏膜上皮细胞的凋亡行为有关。
【关键词】 益胃煎剂; 慢性萎缩性胃炎; 凋亡; 中药
doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.13.076 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2019）13-0-03
慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是消化系统的常见病、疑难病，属于中医胃脘痛、胃痞等范畴，CAG属于胃癌的前期疾病，尤其与肠型胃癌的发病率呈显著相关性，如果不加以控制，可能发展为胃癌[1-3]。西医治疗CAG没有明确的特效药。因此开展中医药对CAG的防治具有重要的临床意义。本实验旨在通过观察益胃煎剂对CAG小鼠胃黏膜病理组织学、凋亡行为的影响，初步探讨其防治CAG的机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料
兔抗Bcl-2多克隆抗体，兔抗Bax单克隆抗体，即用型SABC试剂盒，PV-6001二步法免疫组化检测试剂盒，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 实验动物 SPF级雄性健康小鼠60只，鼠龄5周，体重（20±2）g。购自山东大学医学院实验动物中心。
1.2.2 药物 益胃煎剂（太子参30 g，怀山药25 g，白术10 g，柴胡10 g，木香10 g，香附15 g，白芍12 g，黄芩10 g，鸡内金15 g，山楂15 g，麦芽15 g，神曲12 g，砂仁6 g，法半夏10 g，生甘草6 g）由医院中药房提供，药物浓煎后4 ℃冰箱保存。
1.2.3 造模方法 60只小鼠随机分为三组，每组20只，分别为正常对照组、CAG模型组（模型组）、益胃煎剂干预组（干预组）。正常对照组：正常进食饮水，每天上午定时给予生理盐水1 ml灌胃，1次/d，连续84 d。模型组：正常进食饮水，每天以2%的水杨酸钠溶液0.5 ml灌胃，灌胃前后1 h禁食禁水，连续56 d，造成胃黏膜慢性损伤;以后28 d结合饥饱失常（单日禁食、自由饮水，双日足量食水）。干预组：按上述方法造模56 d后，继续制模的同时给予益胃煎剂1 ml灌胃，1次/d，连续28 d。造模84 d后处死所有小鼠，胃黏膜标本常规固定包埋，进行HE染色，光镜下观察病理形态学变化;应用免疫组织化学法观察胃黏膜细胞Bcl-2、Bax的表达情况。
1.3 观察指标及评价标准
1.3.1 HE染色病理组织学观察 标准参照2002《中药新药临床研究指导原则》（试行）中胃黏膜慢性炎症病理组织学分度标准。
1.3.2 免疫组化染色结果判定 结果判定标准参考文献[4]内容，用阳性细胞标记指数（labeling index，LI）评价，即LI=阳性细胞/计数细胞×100%。每张切片于高倍镜（×400）下随机取连续有代表性的5个以上视野，计数不少于1 000个上皮细胞着色阳性细胞所占百分比。Bcl-2检测结果表示为Bcl-2 LI：胞浆染为棕黄色至棕褐色为阳性细胞，偶见于胞膜、胞核。Bax检测结果表示为BaxLI：胞浆染为棕黄色至棕褐色为阳性细胞，偶见于胞核。
1.4 统计学处理
计量资料的统计描述以（x±s）表示，使用SPSS 11.5软件包中的One-Way ANOVA进行统计推断，两两比较采用SNK法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 光镜观察
（1）正常对照组胃黏膜上皮结构完整，腺上皮和腺管分界清楚。模型组胃黏膜明显萎缩变薄，腺体明显减少，多有不同程度的排列紊乱，个别还见有肠上皮化生。干预组胃黏膜厚度适中，腺体排列较规则，大小形态较一致，见图1～图3。（2）各组小鼠慢性炎症程度比较：模型组慢性炎症程度比正常对照组和干预组高，正常对照组与干预组慢性炎症程度比较无明显差异。
2.2 免疫组化染色结果
（1）Bcl-2：阳性反应物质呈棕黄色或棕褐色，主要位于胞浆内，偶可伴胞膜、胞核着色。正常对照组阳性细胞数较少，模型组阳性细胞数明显增多，干预组阳性细胞明显减少。正常对照组、模型组、干预组Bcl-2 LI分别为（6.10±0.42）、（9.12±1.95）、（7.04±1.49）%，干预组与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），而模型组与正常对照组、干预组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。（2）Bax：阳性反应物质呈棕黄色或棕褐色，主要位于胞浆内，偶可伴胞膜、胞核着色。正常对照组阳性细胞数较多，模型组阳性细胞数明显减少，干预组阳性细胞较模型组明显增多。正常对照组、模型组、干预组Bax LI分别为（26.25±3.68）、（20.16±4.53）、（24.06±3.72）%，干预组与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），而模型组与正常对照组、干预组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。（3）Bcl-2/Bax：正常对照组、模型组、干预组Bcl-2/Bax比值分别为0.22±0.03、0.46±0.09、0.28±0.05，干預组与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），而模型组高于正常对照组、干预组，差异均有统计学意义（P<0.01）。
3 讨论
在CAG治疗方面，目前西医西药尚无特效治疗方法，而近年来中医药治疗显示出其独特优势[5-7]，笔者认为对细胞凋亡的调节可能是中药治疗CAG的重要机制。益胃煎剂是以中医理论为基础，依照中医方剂配伍的基本原则，针对胃癌前病变的主要病机，参考现代药理学研究成果选择药物而组成。君药：太子参、怀山药，太子参益气健脾生津，怀山药补脾养胃，两药共为君药。臣药：柴胡、木香、白芍，白术苦温，燥湿健脾益气，柴胡、木香、白芍共奏疏肝解郁和胃之功。佐药：黄芩、砂仁、鸡内金、山楂、麦芽、神曲、法半夏，黄芩、砂仁清热理气，芳香化湿;鸡内金、山楂、麦芽、神曲消食导滞;法半夏燥湿化痰，消痞散结。使药：甘草性甘味平，调和诸药。诸药配合，标本兼顾，寓消于补，既可益气健脾以补后天，又可疏肝和胃，消痞散结，燥湿化痰，兼可消食导滞[8]。现代药理研究表明，太子参抗疲劳、抗应激;怀山藥调节胃肠道运动、抗肿瘤、促进上皮生长、消炎、抑菌;白术能双向调节胃肠道，保护胃黏膜;白芍具有解除平滑肌痉挛，保护胃黏膜的功能;甘草具有抗溃疡、抗痉挛、抗肿瘤及解毒之功效;且以上诸药皆有免疫调节作用[9]。
细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程。胃黏膜细胞凋亡过程由众多基因共同调控，其中Bcl-2原癌基因家族与凋亡关系密切。研究表明，在CAG中存在Bcl-2过表达与Bax的低表达，这被认为是一种胃癌发生的早期事件[10]。Bcl-2低表达和Bax高表达，即Bcl-2/Bax<1时，说明可能与胃炎有关，而Bcl-2高表达和Bax低表达，即Bcl-2/Bax>1时，说明可能与癌前病变细胞凋亡异常有关[11-12]。本实验结果表明，两者在维持胃黏膜正常结构与生理功能中发挥着不同作用。模型组Bcl-2蛋白阳性表达增加，黏膜全层均有分布，Bax蛋白阳性表达减少，导致Bcl-2/Bax比值升高，说明Bcl-2、Bax正常比例受破坏，正常凋亡受抑制，导致细胞寿命延长，易致肿瘤的发生。经益胃煎剂治疗后Bcl-2表达明显下降，Bax表达明显升高，Bcl-2/Bax比值降低，说明本方可能通过影响细胞凋亡调控基因及癌基因、抑癌基因的表达，参与调控细胞的生长。
综上所述，益胃煎剂能够明显减轻胃黏膜的炎症反应，通过调节Bcl-2、Bax蛋白的表达而影响CAG小鼠胃黏膜上皮细胞的凋亡行为，防止胃黏膜上皮细胞的凋亡受抑，从而逆转CAG及防止癌变。本实验对益胃煎剂防治CAG的机制进行了初步探讨，从实验角度证实了其有效性，为临床治疗CAG和中药的开发提供了一个新处方。
参考文献
[1] Genta R M.Atrophy and atrophic gastritis：one step beyond the Sydney system[J].Ital J Gastroenterol Hepatol，1998，30（Suppl 3）：S273-S275.
[2]于皆平，王小众，张介眉主编.胃部疾病的的诊断和治疗[M].北京：人民卫生出版社，2004：309-317.
[3] Vaux D L，Korsmeyer S J.Cell death in development[J].Cell，1999，96（2）：245-254.
[4] Maeda K，Chung Y S，Onoda N，et al.Proliferating cell nuclear antigen labeling index of preoperative biopsy specimens in gastric carcinoma with special reference to prognosis[J].Cancer，1994，73（3）：528-533.
[5]杨宗保，王亚东，常小荣，等.电针抑制慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜细胞凋亡的作用机制研究[J].中华中医药杂志，2016，31（8）：3005-3008.
[6]李小梅，李雯.丁香胃灵合剂对慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜及Bcl-2蛋白表达的影响[J].四川中医，2015，33（9）：34-36.
[7]彭继升，杨晋翔，安静，等.化瘀解毒益气法对慢性萎缩性胃炎伴异型增生大鼠胃黏膜细胞PCNA水平和凋亡状况的干预研究[J].中医研究，2015，28（3）：49-53.
[8]李长发.和胃煎剂与吗丁啉治疗肝胃不和型功能性消化不良的临床观察[J].中医临床研究，2015，7（20）：85-87.
[9]王本祥主编.现代中药药理学[M].第11版，天津：天津科学技术出版社，1999：895-899.
[10] Guo B，Zhai D，Cabezas E，et al.Human in peptide suppresses apoptosis by interfering with Bax activation[J].Nature，2003，423（6938）：456-461.
[11]李子俊，林秋雄，王启仪，等.胃癌及癌前病变细胞增殖和凋亡与Bcl-2/Bax表达的关系[J].癌症，2000，19（11）：999-1001.
[12] Thornberry N A.Caspases：key mediators of apoptosis[J].Chem Biol，1998，5（5）：R97-R103.
