纯化前后半枝莲多糖的药效学研究
时间：2021-04-23 08:02:19 来源：达达文档网 本文已影响 人 
摘要：采用Sevage法纯化半枝莲（Scutellaria barbata D.Don）多糖，并通过苯酚-硫酸法测定多糖含量；进行急性毒性试验考察半枝莲多糖对小鼠的毒性；通过体内移植肿瘤试验测定不同剂量纯化前后半枝莲多糖对小鼠S180瘤的抑制作用。纯化后半枝莲多糖的纯度为49.99%；急性毒性试验表明800 mg/kg及以下剂量半枝莲多糖对小鼠无毒。纯化后半枝莲多糖的抑瘤率低于半枝莲粗多糖，100 mg/kg半枝莲粗多糖的抑瘤率为46.85%。
关键词：半枝莲（Scutellaria barbata D.Don）；多糖；纯化；急性毒性；抑瘤率
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）03-0659-03
半枝莲（Scutellaria barbata D.Don），别名狭叶韩信草、并头草、牙刷草等，为唇形科黄芩属植物，以干燥全草入药，本品味辛、苦，性寒，归肺、肝、肾经，有清热解毒、散瘀止血、利尿消肿的功能，是一种常用中药[1]。研究表明，半枝莲水提物和醇提物有明显的抗肺癌、消化系统癌、肝癌、乳腺癌、绒膜上皮癌的活性。本研究采用Sevege法将纯度为30%的半枝莲多糖进行纯化，采用限量试验测定其体内急性毒性[2，3]，并比较纯化前后半枝莲多糖的抑瘤效果，为半枝莲多糖药效学评价和抗肿瘤作用与免疫作用机制研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
KM小鼠，体重（20.0±2.0） g，雌雄各半。半枝莲多糖（纯度30%），徐州弘康科技有限公司产品；黄芪多糖（APS），由哈尔滨商业大学博士后工作站提供；环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药股份有限公司，批号10061921；生理盐水，哈尔滨三联药业有限公司，批号100921A14。氯仿，天津市耀华化学试剂有限责任公司，批号20090820；正丁醇，天津市标准科技有限公司，批号20091206；浓硫酸，哈尔滨市新达化工厂，批号101103；苯酚，廊坊市兴达化工有限公司，批号20060213；H2O2，沈阳市新西试剂厂，批号20090711；葡萄糖，北京奥博星生物技术有限责任公司，批号2010223；0.01 mol/L NaHCO3、0.001 mol/L EDAE、无水乙醇，天津市永大化学试剂开发中心，批号20091108；氨水，哈尔滨市新达化工厂，批号090524。
1.2 试验方法
1.2.1 半枝莲多糖样品的纯化[4-7] ①除蛋白。取半枝莲多糖5 g溶于100 mL蒸馏水中，将20 mL Sevage液（氯仿与正丁醇体积比4∶1）加入多糖溶液中，混合物剧烈振摇5 min后4 000 r/min离心10 min，取上层水相反复操作6次。②氧化脱色。除去蛋白后的多糖溶液用体积分数30%的氨水调节pH 8～9，加质量分数10%的双氧水50 mL，置4 ℃冰箱24 h。③除小分子物质。采用透析法除去小分子物质。④醇沉。将透析过的多糖溶液经70 ℃减压浓缩至25 mL，待自然冷却后加入体积分数95%的乙醇调节乙醇体积分数为80%，放置1 d。⑤干燥。将沉淀用适量无水乙醇、丙酮洗涤，干燥后得棕黄色半枝莲多糖粉末。
1.2.2 多糖含量的测定 采用苯酚-硫酸法[7-8]测定溶液中多糖的含量。①葡萄糖标准曲线的绘制。精确量取浓度分别为0、10、20、30、40、50、60 μg/mL的葡萄糖标准溶液各1.0 mL，用蒸馏水补足至2.0 mL，加5%苯酚溶液1.0 mL混匀，迅速加浓硫酸5.0 mL，振摇2 min。用蒸馏水作空白对照，室温放置20 min，流水冲洗。用紫外分光光度计检测其在490 nm处的吸光度。葡萄糖浓度在10～60 μg/mL范围内浓度（C）与吸光度（A）呈良好的线性关系（图1），回归方程为A=0.013 C+0.028，r=0.997 9。②半枝莲多糖含量的测定[8-11]。配制浓度为100 μg/mL的半枝莲多糖溶液，精确量取1.0 mL，稀释后按绘制葡萄糖标准曲线的方法测其A490 nm，计算多糖含量（以葡萄糖计）。
1.2.3 半枝莲多糖溶液的制备 将纯化前后的半枝莲多糖加生理盐水适量溶解，观察溶液均匀度，以不出现肉眼可见的小结晶颗粒的最大浓度作为半枝莲多糖体内试验的试剂[12]，制成32 mg/mL的饱和溶液，并稀释成浓度分别为1、2、4、8、12、16 mg/mL的溶液。
1.2.4 急性毒性试验 选用体重（20.0±2.0）g的健康KM小鼠10只，雌雄各半，以800 mg/kg（32 mg/mL，0.5 mL/只）剂量腹腔注射给药，每天2次。给药后观察7 d，观察期间逐日记录动物的毒性反应情况及死亡状况。
1.2.5 半枝莲多糖抑瘤率的测定 选用体重（20.0±2.0）g的健康KM小鼠150只，随机分为15组，每组10只，雌雄各半。抽取接种第7 d的生长良好的S180荷瘤小鼠腹水（活癌细胞数>97%），3倍体积无菌生理盐水稀释，按0.2 mL/只（细胞浓度约2×107个/mL）小鼠右前腋皮下接种，整个操作应在无菌条件下进行，30 min内操作完毕。小鼠接种S180瘤24 h后分别按400、300、200、100、50、25 mg/kg的剂量腹腔注射半枝莲粗多糖和半枝莲纯化多糖溶液，以100 mg/kg黄芪多糖溶液和30 mg/kg环磷酰胺溶液为阳性对照，空白对照组注射生理盐水0.2 mL/只，连续给药7 d，1次/d，停药后次日处死，称取瘤重，计算抑瘤率。
2 结果与分析
2.1 半枝莲多糖的纯化结果
干燥后得棕黄色半枝莲多糖粉末0.3 g，收率为6%。按“1.2.2”的方法测定纯化后半枝莲多糖的含量，计算得到纯化产物半枝莲多糖的纯度为49.99%，比纯化前的纯度提高了19.99个百分点。
2.2 急性毒性试验结果
一日内两次腹腔注射小鼠半枝莲多糖800 mg/kg，第一天给完药时小鼠的活动能力和食欲有所下降，第二天即恢复正常。之后给药7 d内未见动物死亡，并且毛色、食欲均正常，无明显的机体病变。
2.3 纯化前后半枝莲多糖的抑瘤率
不同剂量纯化前后半枝莲多糖对小鼠S180瘤的抑瘤率结果见表1。在试验范围内，纯化前后半枝莲多糖的抑瘤率均随其剂量的增加呈先升高后降低的趋势，剂量为100 mg/kg时纯化前后半枝莲多糖的抑瘤率均为最高，此时半枝莲纯化多糖组抑瘤率为27.63%，半枝莲粗多糖组抑瘤率为46.85%，与空白对照、50、100和200 mg/kg半枝莲粗多糖组抑瘤率相比有明显的差异。纯化后半枝莲多糖的抑瘤效果明显弱于粗多糖的，原因可能是纯化过程中被去除的蛋白或小分子物质也参与或协助了多糖的抗肿瘤作用。
3 小结与讨论
应用Sevage法除蛋白、双氧水脱色、透析、醇沉，纯化后半枝莲多糖的纯度比半枝莲粗多糖的纯度有明显提高，采用苯酚-硫酸法测多糖含量，测定时最好在20 min内完成，时间过长吸光度会有所下降。
急性毒性的测定可为新药研发过程中各种剂量、临床上的各监测指标等提供参考的依据。本试验中半枝莲多糖毒性很低，所以根据《药理试验方法学》中的要求仅采用限量试验进行急性毒性试验。半枝莲多糖一日内两次给予小鼠800 mg/kg的剂量，7 d内未见动物死亡，并且毛色、食欲均正常，无明显的机体病变，这说明受试动物在此剂量下基本没有毒性反应，即可认为半枝莲多糖在800 mg/kg及以下剂量都是无毒的。
体内移植肿瘤试验观察到半枝莲多糖对小鼠S180瘤有抑制作用。连续腹腔注射给药7 d后，纯化前半枝莲多糖的抑瘤效果明显优于纯化后的半枝莲多糖，100 mg/kg半枝莲粗多糖抑瘤率为46.85%，而纯化后半枝莲多糖抑瘤率不符合关于抗肿瘤中草药有效性的标准（抑瘤率>30%）[13]，故采用30%半枝莲多糖完成后续研究。
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