基于星点设计法优化马齿苋多糖的提取工艺
时间：2021-01-13 14:06:24 来源：达达文档网 本文已影响 人 
张志 高畅 付玲玲
摘要：旨在用星点设计-响应面法优化马齿苋多糖的提取工艺。采用超声辅助提取法提取马齿苋多糖，以多糖提取率为评价指标，通过提物温度、提取时间、料液比、提取次数等单因素结合星点设计法-响应面试验进一步优化提取工艺条件。结果表明，最佳提取工艺为提取温度70 ℃、提取时间43 min、料液比1 g ∶23 mL、超声功率230 W，在该条件下，马齿苋多糖提取率的预测值为6.419%，实测平均值为6.524%。由结果可知，该方法模型的预测性良好，提取条件稳定，提取过程简便合理、可靠。
关键词：马齿苋;多糖;超声提取;响应面-星点设计;提取率
中图分类号：
R284.2文献标志码：
A
文章编号：1002-1302（2020）08-0207-06
收稿日期：2019-04-01
基金项目：吉林农业科技学院青年基金（编号：吉农院合字[2018]第3004号）。
作者简介：张 志（1981—），男，黑龙江哈尔滨人，硕士，讲师，主要从事药物有效成分提取及药物制剂研究。Tel：（0432）63509964;E-mail：zz004@163.com。
马齿苋（Portulaca oleracea L.），别称马苋、五行草、长命菜等，属于一年生肉质类草本植物。《本草纲目》记载“其叶并比如马齿，而性滑利似苋，故名马齿苋”[1]。马齿苋是被世界卫生组织提名的最有用处的药用植物之一，也是药食同源的野生植物之一[2]。目前，市场上研发的主要是马齿苋食用产品，如功能饮料，此外还有含有马齿苋的化妆品等，而作为药品使用的马齿苋的利用率较低。马齿苋的活性成分主要有多糖、黄酮、有机酸、生物碱等，目前对于马齿苋多糖的研究主要集中在药理活性方面，对马齿苋多糖的相关研究显示，其药理活性主要是降低血糖数值，也可以降低血脂，同时具有抗氧化、抗病毒等功效，具备很好的药用功能[3-6]。近年来，关于马齿苋多糖提取工艺的研究也陆续有不少报道，大多数采用传统的水提醇沉的提取方法，但是由于水的极性大，容易将马齿苋中溶于水的其他成分一起浸提出来，给后续的分离纯化增加了难度[7]。因此，本试验采用星点响应面法优化马齿苋多糖的超声提取工艺，以期实现马齿苋多糖提取的新突破，从而为后续马齿苋多糖的药用价值开发奠定一定的物质基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
具有根、茎、叶的新鲜马齿苋全株采摘于花期前，采摘地点为吉林省吉林地区，经吉林农业科技学院鉴定确认。
1.2 试验试剂
D-葡萄糖（分析纯），天津市恒兴化学试剂制造有限公司;苯酚（分析纯），天津基准化学试剂有限公司;石油醚、丙酮、乙醚（分析纯），天津市致远化学制剂有限公司。
1.3 仪器与设备
KQ-50DA型数控超声波提取机，昆山市超声仪器有限公司;725N紫外-可见分光光度计，上海精科仪器有限公司;R1001-VN旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司;AUY220电子分析天平，日本岛津公司。
1.4 试验方法
1.4.1 马齿苋多糖的超声提取及含量检测[8] （1）标准曲线的制备。采用苯酚-硫酸法，精确称取1 g于105 ℃干燥至恒质量的葡萄糖标准品，以蒸馏水为溶剂，溶解定容于100 mL容量瓶中，摇匀后从中量取1 mL溶液，定容于100 mL容量瓶中并摇匀，即得 0.1 mg/mL 葡萄糖标准溶液。分别准确量取上述溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于5个10 mL容量瓶中，再各加1.0 mL 6%苯酚試剂摇匀，之后迅速加入5 mL浓硫酸溶液，将试管放入沸水中显色15 min，冷却至室温定容。以水为空白，用紫外-可见分光光度计于490 nm波长处测吸光度，得到葡萄糖标准曲线回归方程。
（2）马齿苋的前期处理。将新鲜马齿苋全株用自来水冲洗以去除表面杂质，将冲洗后的马齿苋在阴凉干燥处晾至无水分，放入55 ℃干燥箱中烘干。将干燥后的马齿苋用粉碎机粉碎，过40目筛后于密封袋中保存。称取适量马齿苋干品置于索氏提取器中，用5倍石油醚连续回流脱脂2次，再用5倍95%乙醇回流提取2次，以除去马齿苋干品中的单糖、低聚糖、苷类等杂质，将滤渣于通风处晾干。经上述处理后，将所得马齿苋粉末于65 ℃恒温干燥箱中干燥至恒质量，用于多糖的提取。
（3）马齿苋多糖的超声提取。称取一定量经上述方法处理的马齿苋粉末，放置在100 mL圆底烧瓶中，以水作为提取溶剂，按照不同提取温度、提取时间、超声功率、料液比进行提取，将所得提取液趁热抽滤，减压浓缩，离心去除杂质，加入无水乙醇沉淀，静置24 h后过滤，用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤数次，在60 ℃干燥箱中干燥至恒质量，即得马齿苋多糖粗品。
（4）样品液中多糖含量的测定。称取上述试验制得的马齿苋多糖粗品1 g，用蒸馏水溶解。按照步骤（1）的方法，采用苯酚-硫酸法测定马齿苋粗多糖中的多糖含量。测定样品吸光度，根据葡萄糖标准曲线与回归方程，计算样品中的葡萄糖含量，马齿苋多糖提取率的计算公式如下：
马齿苋多糖提取率=样品中的多糖含量×粗多糖质量/原材料质量×100%。
1.4.2 单因素的考察 （1）提取温度对马齿苋多糖提取率的影响。分别准确称取5份经“1.4.1”节步骤（2）的方法处理后的马齿苋干品2 g，置于 100 mL 圆底烧瓶中，按照1 g ∶25 mL的料液比加入蒸馏水，在超声功率为200 W、提取时间为 50 min、提取温度为40、50、60、70、80 ℃的条件下进行2次提取试验。所得提取液经离心处理后，弃去残渣。将上清液浓缩醇沉后定容至100 mL容量瓶中，用移液管精确吸取3 mL稀释液加入比色皿中，再通过苯酚-硫酸法测定其中的多糖含量。
（2）提取次数对马齿苋多糖提取率的影响。根据“1.4.2”节的试验步骤（1），设定提取温度为 60 ℃，进行1、2、3、4、5次重复提取试验，测定所得提取液中的多糖含量。
（3）提取时间对马齿苋多糖提取率的影响。参照“1.4.2”节的试验步骤（1），设定提取温度为 60 ℃，提取时间分别为20、30、40、50、60 min，进行2次提取试验，测定所得提取液中的多糖含量。
（4）料液比对马齿苋多糖提取率的影响。参照“1.4.2”节的试验步骤（1），设定提取温度为60 ℃，提取时间为40 min，分别选取料液比为1 g ∶15 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL、1 g ∶35 mL，进行2次提取试验，测定所得提取液中的多糖含量。
（5）超声功率对马齿苋多糖提取率的影响。参照“1.4.2”节的试验步骤（1），设定提取温度为 60 ℃，提取时间为40 min，料液比为1 g ∶25 mL，分别选取超声功率为100、200、300、400、500 W，进行2次提取试验，测定所得提取液中的多糖含量。
1.4.3 响应面优化 以上述单因素预试验结果为基础，选取马齿苋多糖得率（y）为因变量，以提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）和超声功率（D）为自变量。采用响应面-星点设计对试验数据进行拟合，选择的各水平及其对应的编码值见表1。
2 结果与分析
2.1 葡萄糖標准曲线[8]
参照“1.4.1”节的方法，以吸光度（D490 nm）为纵坐标、浓度（C）为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。如图1所示，葡萄糖在0.02～0.10 mg/mL的浓度范围内呈良好的线性关系，其回归方程如下：y=6.695x+0.130 1，r2=0.993 7。
2.2 单因素考察结果与分析
2.2.1 提取温度对马齿苋多糖提取率的影响 由图2可知，马齿苋多糖提取率随提取温度的增大呈逐步上升的趋势。在60 ℃时曲线首次达到较高点，当温度继续升高时，曲线趋于水平，由此可见，当温度超过60 ℃后多糖提取率的变化不明显。
2.2.2 提取次数对马齿苋多糖提取率的影响 从图3可以看出，提取次数对马齿苋多糖提取率影响的曲线整体趋于水平，可见提取次数对多糖提取率的影响不大。提取次数越多，多糖提取率越高，但是考虑到具体试验操作的可行性和实际性，将提取次数定为2次。由于提取次数对多糖提取率的影响不显著，不将其列入星点设计的考察因素中。
2.2.3 提取时间对马齿苋多糖提取率的影响 由图4可知，当提取时间为40 min时，多糖提取率达到最大值;当提取时间小于40 min时，曲线呈明显的上升趋势，多糖提取率升高;当提取时间超过 40 min 时，曲线呈下降趋势，多糖提取率降低。
2.2.4 料液比对马齿苋多糖提取率的影响 由图5可知，当料液比为1 g ∶25mL时，多糖提取率高于6.0%;当料液比超过1 g ∶25 mL时，虽然多糖提取率随着料液比的增加而继续提高，但多糖提取率的提高幅度逐渐降低;当料液比小于1 g ∶25 mL时，多糖提取率的提高幅度逐渐上升，可见最初的多糖提取率与料液比呈正相关关系。
2.2.5 超声功率对马齿苋多糖提取率的影响 由图6可知，当超声功率为200 W时，多糖提取率达到最大值;当超声功率大于200 W时，曲线开始急剧下降，多糖提取率降低，说明超声功率过大时，对多糖提取率有较大影响。
2.3 响应面-星点设计数据的记录与处理
综合上述单因素试验结果，以马齿苋多糖提取率（y）作为响应值，以提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）和超声功率（D）作为提取因素进行多元回归拟合，试验结果见表2。
采用Design-Expert 10软件对表2中的一些数据进行响应面分析与拟合，以多糖提取率（y）作为响应值，然后对因素A、B、C、D作多元线性回归，并利用二项式方程进行拟合，模型如下：
Y=6.13+0.22A+0.10B+0.039C+0.34D-0.051AB+0.025AC-0.032AD-0.060BC+0.070BD+0.041CD-0.58A2-0.11B2-0.038C2-0.49D2（R2=0.9142）。
为了检验二项式拟合方程的有效性，对所得模型进行了方差分析。由表3中的数据可以直观地看出，这个模型有着极高的显著性特点（P<0.000 1），从失拟项中可以看出，多糖提取率的F=1.89（P=0.215 2），失拟项不显著，表明这个模型对于多糖提取率的干扰是不显著的，该回归方程与实际的拟合误差很小，完全能够用来进行预测和分析，非常适合用于分析马齿苋超声提取多糖的流程和工艺优化。由P值可以看出，A、B、C、D、AB、AC、A2、B2、C2、D2 这几个变量对于多糖提取率都有不同程度的干扰作用。
2.4 响应面参数优化与最佳工艺条件的预测
2.4.1 最佳工艺条件的预测 根据上述回归分析结果，将多糖提取率与影响因素A、B、C、D及其交互作用拟合为三维曲面图，以拟合目标函数为数学模型，绘制因素间的等高线和三维（3D）响应图，以期确定马齿苋多糖提取的最佳工艺条件。图7中的颜色变化越快、坡度越大、三维图的倾斜率越高，对试验结果的影响越显著。在选定的范围内，等高线中最小椭圆中心位置的点，既是极值，也是3D响应面的最高点。等高线呈圆形，表示2个因素的交互作用不明显，等高线呈椭圆形则相反。对马齿苋多糖提取率影响最大的因素是超声功率，其次是提取温度和料液比，而提取时间的影响最小。由图7还可以看出，除了提取时间和超声功率外，各因素间均有比较明显的交互作用。
2.4.2 最佳提取工艺的确定及验证试验 通过Design-Expert 10软件对二项式模型进行相关预测后，笔者获取了最佳工藝流程：提取温度为70℃，时间为42.7 min， 料液比为1 g ∶23 mL， 超声功率为230 W，在该条件下，所得多糖提取率为6.524%。考虑到试验的可操作性，将提取时间修正为43 min。为了验证提取工艺的有效性，按照修正后的最佳提取工艺，本研究进行了3次平行试验，最后得到多糖提取率均值为6.419%，实际值对于预测值的相对误差为1.61%，说明用响应曲面法-星点分析得到的理论最佳工艺具有一定的可信度和有效性。
3 结论
本试验采用超声技术提取马齿苋中的多糖，以单因素试验为基础，通过响应曲面法-星点分析多元回归拟合，对影响多糖提取率的主要4个因素（提取温度、提取时间、料液比、超声功率）进行考察，建立相互作用的数学模型，得到的最终提取工艺条件如下：温度为70 ℃，时间为43 min，料液比为 1 g ∶23 mL，超声功率为230 W，多糖提取率为6.419%。结果说明，基于星点-响应面法确定的提取工艺条件相对于传统的提取方法可行，多糖提取率有所提高。
参考文献：
[1]雷红伟. 马齿苋黄酮有效部位改善胰岛素抵抗的作用机理研究[D]. 武汉：华中科技大学，2010：13.
[2]罗开萍，李 艳，陈可宙，等. 我国马齿苋研究现状分析[J]. 现代农业科技，2010（1）：110-111.
[3]田光辉，刘存芳，赖普辉. 马齿苋多糖的超声提取及活性试验研究[J]. 食品研究与开发，2007，28（2）：7-10.
[4]王晓波，刘殿武，丁月新，等. 马齿苋多糖对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能作用[J]. 中国公共卫生，2005，21（4）：462-463.
[5]朱晓宦，吴向阳，仰榴青，等. 马齿苋粗多糖的提取及清除羟自由基活性作用[J]. 江苏大学学报（医学版），2007，17（1）：57-60.
[6]崔 旻，尹 苗，安利国. 马齿苋多糖的抗肿瘤活性[J]. 山东师大学报（自然科学版），2002，17（1）：73-76.
[7]赵 宇，彭晓霞. 多糖类化合物提取工艺研究[J]. 甘肃科技纵横，2006，35（2）：223-224.
[8]高 畅，付玲玲、张 志. 马齿苋多糖的提取工艺优化[J]. 吉林农业，2018（7）：52-53.
