【高压培养对血管内皮细胞ｔ－ＰＡ和ＰＡＩ－１的影响及卡托普利干预的效果】血管内皮细胞

　　[摘要]目的：高血压常伴有纤溶功能的异常，但其机制尚不清楚。本研究拟观察高静水压培养对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）t-PA和PAI-1的影响以及卡托普利的干预效果，并探讨其可能的作用机制。方法：选用第4～6代HUVECs，接种于24孔培养板中。依培养压力分为3组：大气压组（0 mmHg），中压组（90 mmHg），高压组（180 mmHg）。在同一压力组，根据不同药物干预又分为两个亚组。即对照组（Ctrl）和卡托普利组（Cap，10-5 mol/L）。每组6份标本。采用ELISA法测定上清液t-PA和PAI-1的抗原浓度，并用细胞内总蛋白进行标化（单位：ng/μg proteins）。同时测定细胞内Ca2+浓度（nmol/L）。结果：与大气压组相比，中压和高压组t-PA浓度均显著降低，PAI-1浓度显著增高，t-PA/PAI-1比值显著降低，[Ca2+]i也显著增高。卡托普利对大气压组的t-PA、PAI-1和[Ca2+]i无显著影响，但在两个高压组，卡托普利显著升高t-PA浓度，显著降低PAI-1浓度，t-PA/PAI-1比值显著升高，[Ca2+]i显著地降低。结论：高静水压可损害内皮细胞的纤溶功能，而卡托普利的干预可降低高压所升高的[Ca2+]i，并改善高静水压对内皮细胞纤溶功能的影响。
　　[关键词]血管内皮细胞；高静水压；卡托普利；组织型纤溶酶原激活物；纤溶酶原激活物抑制剂-1
　　[中图分类号]R34 [文献标识码]B[文章编号]1673-7210（2007）10（c）-077-03
　　
　　Effects of high hydrostatic pressure on the t-PA and PAI-1 secretions of vascular endothelial cells and the interfering results of Captopril
　　LU Yin-hui1,CHENG Xiao-shu2, SU Hai2, RAO Fang2
　　(1.Deartment of Officer"s Health, Jiangxi Provincial People"s Hospital, Nanchang 330006,China;2.Department of Cardiology, The Second Affiliate Hospital of Jiangxi Medical College,Nanchang 330006,China)
　　[Abstract]Objective: Clinical studies have demonstrated that hypertension often accompanies abnormality of fibrinolytic function. In this study,we investigated the effects of high hydrostatic pressure on the concentrations of t-PA and PAI-1 antigen in culture medium of human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) and observed the interfering results of Captopril. Methods: HUVECs harvested between passages 4 and 6 were used for the experiments.According to the cultured pressure, they were divided into three groups:atmospheric pressure group(0 mmHg),middle pressure group(90 mmHg),and high pressure group(180 mmHg). The above three groups were respectively divided into two subgroups（6 samples/subgroups）, control group and Captopril group(10-5 mol/L). At the end of the culture period, supernatants were collected to measure the concentrations of t-PA and PAI-1 antigens by using ELISA kit. Concentrations of t-PA and PAI-1 antigens were normalized with intracellular proteins(Unit: ng/μg proteins). Meanwhile, the concentration of intracellular free calcium ([Ca2+]i) was detected(Unit:nmol/L). Results: Comparing with atmospheric pressure group, high hydrostatic pressure induced a dramatic reduction in t-PA antigen and a dramatic increase in PAI-1 antigen. Meanwhile, high hydrostatic pressure significantly increased [Ca2+]i. At atmospheric pressure group, captopril showed no significant effects on the concentrations of intracellular calcium, t-PA and PAI-1 antigens. However, capropril significantly reversed the effects of high hydrostatic pressure, increased the level of t-PA, decreased the level of PAI-1, decreased [Ca2+]i. Conclusion: High hydrostatic pressure can decrease the level of t-PA antigen and increase the level of PAI-1 antigen in HUVECs culture medium, which results in abnormality of fibrinolytic function. Captopril can depress[Ca2+]i increase induced by high hydrostatic pressure, and improve its fibrinolytic function.
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　　血栓性疾病是高血压常见的致残和死亡原因，降压治疗能显著降低高血压患者血栓形成的危险，这暗示高血压与血管内抗血栓功能的紊乱有关[1]。由血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VECs）合成并释放的组织型纤溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator, t-PA）和Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂（plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）是纤溶系统的关键性的调节物质。研究表明，高血压患者复杂的血流动力学会影响血管内皮细胞的功能，但高血压时显著增高的静水压对VECs分泌t-PA及PAI-1的影响及其作用机制以及卡托普利干预的效果尚未见详细报道。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 材料
　　人脐静脉内皮细胞系（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）由中国医学科学院上海细胞研究所提供。t-PA和PAI-1诊断试剂盒（ELISA法）购自上海太阳生物技术公司。荧光钙探针Fluo-3/AM购自Caibiochem公司。卡托普利针（Captopril，Cap）：江苏常州制药厂，批号：990819。贮存浓度为5×10-4 mol/L，使用终浓度为10-5 mol/L。采用Typan Blue染色和细胞记数方法进行细胞毒性试验，验证本研究所用的各药物浓度对细胞生长无显著毒性，细胞存活率达90%以上。
　　1.2 压力培养方法
　　高压培养装置由我们研究所自行研制设计，由带有压力表和进气阀的高压锅组成。高压锅置于37℃、5％CO2细胞培养箱中，通过进气阀向高压锅内持续供应气体以调节压力稳定在预定的水平。取第4～6代的HUVECs用于实验，接种于24孔培养板中。每孔加入浓度为5×104个/ml的细胞悬液1 ml。待细胞长至融合状态，改含2% FBS的DMEM孵育24 h。再更换无血清DMEM培养液，并加入相应浓度的药物，置相应压力条件下，于细胞培养箱中培养12 h。取上清液用于检测t-PA与PAI-1抗原。消化下VECs用于测定细胞内总蛋白和细胞内Ca2+浓度即[Ca2+]i。
　　1.3 实验分组
　　依培养压力分为大气压组（0 mmHg），中压组（90 mmHg），高压组（180 mmHg）3组。在同一压力组，根据不同药物干预又分为两个亚组，即对照组（Ctrl）、卡托普利组（Cap）。每组6份标本。
　　1.4观察指标及测定方法
　　1.4.1采用ELISA法测定上清液中t-PA和PAI-1抗原含量 采用酶联免疫吸附双抗体夹心法测定培养液中t-PA和PAI-1抗原浓度。包被抗体与待测标本中的抗原结合，加入酶标抗体后形成复合物，后者与底物作用呈现显色反应。492 nm处测得的A值与待测标本中抗原含量成正比。以A492对抗原标准品浓度（ng/ml）在普通座标纸上作标准曲线，待测标本抗原含量可从标准曲线上查出。
　　1.4.2考马斯亮蓝测定法测定细胞内总蛋白内皮细胞离心沉淀后，加入0.5 ml 0.1%十二烷基硫酸钠，置100℃，30 min，使细胞裂解。取1.0 ml考马斯亮蓝染液与100 μl上述细胞裂解液混匀，放置10 min。用可见光分光光度计在595 nm波长处测定溶液的光吸收值。以溶剂为空白对照，以牛血清白蛋白为标准品绘制标准曲线。然后依据标准曲线推算样品中蛋白质含量（μg/ml）。胞内总蛋白含量用于t-PA和PAI-1浓度的标化（单位为ng/μg proteins）。
　　1.4.3 采用FLUO-3/AM荧光钙探针检测[Ca2+]iFluo-3与钙离子有高度亲和力，结合后可被一定波长的紫外光激发产生荧光，其荧光强度与钙离子浓度成正比，故可测定 [Ca2+]i。用二甲基亚砜溶解Fluo-3/AM，浓度为3 mmol/L。用无外钙的D-Hanks液调整Fluo-3/AM至终浓度为6 μmol/L。取VECs悬液1 ml（1×106 个/ml）和Fluo-3/AM溶液混合，避光37℃孵育30 min。用缓冲液清洗VECs 2次，离心弃上清，再用缓冲液重悬细胞，加入CaCl2至终浓度为1.8 mmol/L。采用流式细胞仪进行检测，荧光激发波长为506 nm。设测量时细胞流速为中速，测量时间分辨率为200 ms。每组检测225 s。在散点图中读取平均荧光强度。分别用A23187和EGTA测定最大（Fmax）和最小（Fmin）荧光值。[Ca2+]i计算公式为：[Ca2+]i=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)。Kd=400 nmol/L为Fluo-3/AM与Ca2+结合经校正后的解离常数，F为实验细胞所测得的荧光强度。
　　1.5统计学方法
　　所有数据均以均数±标准差表示。应用SPSS软件进行统计分析，均数之间差别以t检验分析。多组间均数的比较采用One-Way ANOVA（S-N-K）分析，以P＜0.05为有显著统计学差异标准。
　　
　　2 结果（表1）
　　
　　与大气压组相比，中压和高压组t-PA浓度均显著降低，PAI-1浓度显著增高，t-PA/PAI-1比值显著降低，[Ca2+]i显著增加。并有随压力增高变化更为显著的趋势。
　　卡托普利对大气压组的t-PA、PAI-1和[Ca2+]i无显著影响，但在两个高压组，卡托普利显著升高t-PA浓度，显著降低PAI-1浓度，t-PA/PAI-1比值显著升高，[Ca2+]i显著降低。
　　
　　3 讨论
　　
　　静水压为血液对血管壁的侧压力，垂直作用于血管壁的全层。高血压时血管壁所承受的静水压明显增高。我们利用自行研制的高压培养装置培养内皮细胞来模拟高血压时侧压力的作用，早期的研究发现高静水压可造成VECs生长和功能损害[2,3]。本研究结果表明，与大气压培养条件相比，加压培养后培养液中t-PA浓度降低，而PAI-1浓度增加，t-PA/PAI-1比值显著降低。并且随压力增高，这种变化表现得更为明显。这反映高静水压可直接影响VECs的纤溶功能，造成VECs纤溶功能降低。
　　关于内皮细胞识别血流动力学变化的机制，现在尚不清楚。近年来对机械信号转导的研究表明，内皮细胞腔侧质膜上可能存在潜在的机械刺激感受器［4,5］, 这些称为“机械受体”的膜结构主要包括离子通道、G-蛋白结合受体、酪氨酸激酶及整合素族［6］。
　　机械刺激可引起VECs离子通道与G-蛋白结合受体激活，[Ca2+]i发生变化[7]。本研究发现，高静水压使[Ca2+]i增高。Yamamoto 等[8]也发现通过升高[Ca2+]i和激活PKC途径可刺激PAI-1合成增多。Hishikawa等[9]发现的电压依赖性钙通道阻滞剂硝苯地平和张应力激活的钙通道抑制剂钆对静水压引起的钙离子增高没有影响，故认为静水压升高内皮细胞钙离子与上述两个途径无关；而磷脂酶C（PLC）抑制剂和蛋白激酶C（PKC）抑制剂均可降低静水压诱导的[Ca2+]i升高。因此，静水压升高[Ca2+]i可能的机制是，静水压的增加通过压力感受器刺激VECs磷酸肌醇系统，激活PLC，促使肌醇磷脂水解，生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DAG）。IP3作用于胞内Ca2+池或胞膜上的Ca2+通道，导致[Ca2+]i增高[10]。Ca2+在DAG的参与下激活PKC，激活腺苷环化酶。调节细胞内部的生化反应，导致t-PA和PAI-1基因表达与合成的改变[11,12]。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　肾素-血管紧张素系统在高血压的发生、发展中起着重要的作用。研究表明，RAS可能在调节循环和局部血管的PAI-1表达上发挥重要的作用，从而影响到纤溶平衡[13]。本实验研究也发现，常压培养时，卡托普利对t-PA和PAI-1浓度无明显影响，也不影响VECS内钙离子浓度；但在高压培养时，卡托普利可明显减轻高压所致的t-PA浓度降低和PAI-1浓度增高的程度，同时由高压导致的增高的[Ca2+]i也显著降低。表明卡托普利可改善高压培养下的VECS的纤溶功能，对其起一定的保护作用。
　　综上所述，我们认为高静水压可直接导致HUVECs纤溶功能降低。而卡托普利的干预可降低高压所升高的[Ca2+]i，并对抗高静水压对VECS纤溶功能的影响。
　　
　　[参考文献]
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　　（收稿日期：2007-08-07）
　　
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