多巴酚丁胺对脓毒症休克兔急性肺损伤的影响

孙才智 秦海东 沈华 宋杨 张铮

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.12.009

基金项目：南京市医学科技发展项目（YKK12074）

作者单位：210006  南京，南京医科大学附属南京医院（南京市第一医院） 急诊科

通信作者：张铮，Email：
Zz18351891108@126.com

【摘要】目的探讨不同剂量多巴酚丁胺对脓毒症休克兔急性肺损伤（acute lung injury ，ALI）的保护作用及其可能机制。方法采用盲肠结扎穿孔联合静脉注射内毒素制备脓毒症休克模型，将70只新西兰雄性大白兔随机（随机数字法）均分为假手术组（A组）、ALI模型组（B组）、多巴酚丁胺低剂量组（C组）、多巴酚丁胺中剂量组（D组）和多巴酚丁胺高剂量组（E组），分别于造模后3 h和6 h点处死，留取肺组织标本。ELISA法检测环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate， cAMP）浓度;Western-blot法检测水通道蛋白5（Aquaporin 5， AQP5）蛋白浓度;计算肺湿/干重（wet to dry weight， W/D）比值;光镜和电镜下观察各组小鼠肺组织病理学改变，并对肺组织病理损伤进行评分。多组间差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD法。结果与A组相比，B组cAMP、AQP5蛋白浓度在3 h及6 h明显降低（3.53±0.43） pmol/mL vs. （21.18±0.62）pmol/mL;（0.44±0.04）pmol/mLvs.（0.99±0.06）pmol/mL; （2.71±0.56）pmol/mL vs.（21.78±0.62）pmol/mL;（0.29±0.05）pmol/mLvs.（0.91±0.06）pmol/mL;P<0.001，W/D比值则明显升高P<0.00。与B组相比， C组cAMP及AQP5蛋白水平在6 h明显增加（8.48±0.61）pmol/mLvs.（2.71±0.56）pmol/mL， P<0.001;（0.49±0.04）pmol/mLvs.（0.29±0.05）pmol/mL，（P=0.001），D、E组cAMP及AQP5蛋白水平在3 h、6 h明显增加（10.86±0.66）pmol/mL vs.（3.53±0.43）pmol/mL;（0.60±0.05）pmol/mLvs.（0.44±0.04）pmol/mL;（13.80±0.49）pmol/mLvs.（2.71±0.56）pmol/mL;（0.64±0.03）pmol/mLvs.（0.29±0.05）pmol/mL;（15.57±0.60）pmol/mLvs.（3.53±0.43）pmol/mL;（0.91±0.05）pmol/mLvs.（0.44±0.04）pmol/mL;（19.30±0.42）pmol/mLvs.（2.71±0.56）pmol/mL;（0.89±0.08）pmol/mLvs.（0.29±0.05）pmol/mL;P<0.01，E组W/D比值明显降低（P=0.002; P=0.001）。与C 、D组相比， E组cAMP及AQP5水平在3 h、6 h均有所增加（P<0.01）。光镜及电镜下，B组肺的病理形态及超微结构损伤均较重， 肺病理学评分明显升高（P<0.01）;多巴酚丁胺干预后，肺的病理形态及超微结构损伤有所减轻，肺组织病理学评分明显降低（P<0.01）。结论多巴酚丁胺对内毒素诱导的急性肺损伤有一定程度保护作用，其机制可能与提高肺组织cAMP水平，上调AQP5蛋白表达量有关，且大剂量多巴酚丁胺效果更佳。

【关键词】急性肺损伤;脓毒症休克;多巴酚丁胺;水通道蛋白5;环磷酸腺苷

Effects of dobutamine on acute lung injury in rabbits of septic shock

Sun Caizhi ， Qin Haidong， Shen Hua， Song Yang， Zhang Zheng. Department of Emergency， Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing Medical University/the First Hospital of Nanjing， Nanjing210006， China

Corresponding Author：
Zhang Zheng， Email：
Zz18351891108@126.com

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of different doses of dobutamine on acute lung injury （ALI） in rabbits with septic shock and to clarify the possible mechanism. Methods  The rabbits model of septic shock was made by cecal ligation and puncture combined with intravenous injection of endotoxin， 70 male New Zealand white rabbits were randomly divided into five groups（14 rabbits in each groups）：
sham operation group （group A），ALI group （group B）， dobutamine low-dose group （group C）， dobutamine medium-dose group（group D） and dobutamine high-dose group（group E）， 7 rabbits from each group were sacrificed 3 h and 6 h after septic shock. The level of cyclic adenosine monophosphate （cAMP） in lung tissue was detected by ELISA .The expression of aquaporin 5 （AQP5） protein was determined by western blotting. The wet to dry weight （W/D） ratio was measured. The pathological and ultrastructural changes of lung tissue were evaluated by optical microscopy and electron microscope， and lung injury score was assessed. The differences among the different groups were analyzed by one-way ANOVA （LSD test）. Results  The level of cAMP and expression of AQP5 protein in lung tissue at 3 h and 6 h were dramatically lower in group B than those in group A （3.53±0.43） pmol/mLvs. （21.18±0.62）pmol/mL;（0.44±0.04） pmol/mLvs.（0.99±0.06）pmol/mL;（2.71±0.56） pmol/mLvs.（21.78±0.62）pmol/mL;（0.29±0.05）pmol/mLvs.（0.91±0.06）pmol/mL; all P<0.001， while the W/D ratio was obviously higher in group B than those in group A （all P<0.001）. Compared with group B， the level of cAMP and AQP5 protein expression in lung tissue were significantly increased at 6 h in group C （8.48±0.61）pmol/mLvs.（2.71±0.56）pmol/mL， P<0.01; （0.49±0.04）pmol/mLvs.（0.29±0.05）pmol/mL，P=0.001 and at 3 h and 6 h in group D and E （10.86±0.66）pmol/mLvs.（3.53±0.43）pmol/mL;（0.60±0.05）pmol/mLvs.（0.44±0.04）pmol/mL;（13.80±0.49）pmol/mL vs.（2.71±0.56）pmol/mL;（0.64±0.03）pmol/mLvs.（0.29±0.05）pmol/mL; （15.57±0.60）pmol/mL vs.（3.53±0.43）pmol/mL;（0.91±0.05）pmol/mLvs.（0.44±0.04）pmol/mL; （19.30±0.42）pmol/mL vs.（2.71±0.56）pmol/mL; （0.89±0.08）pmol/mL vs.（0.29±0.05）pmol/mL; all P<0.01， while the W/D ratio in group E was decreased obviously（P=0.002; P=0.001）. Compared with group C and D， the level of cAMP and the expression of AQP5 protein at 3 h and 6 h in group E increased significantly（all P<0.01. The pathological and ultrastructural changes of lung tissue were more intensive in group B than those in group A and the lung injury scores were obviously higher （P<0.01）. The degree of lung pathological and ultrastructural lesion was ameliorated after administration of dobutanmine. Additionally， histological scores decreased significantly（P<0.01）. ConclusionsOur study demonstrated that dobutamine could improve ALI induced by endotoxin， the mechanism of protective effect may involve in increasing the level of cAMP and up-regulating the AQP5 protein expression， and high-dose dobutamine had better effects.

【Key words】Acute lung injury; Septic shock; Dobutamine; Aquaporin 5; Cyclic adenosine monophosphate

在脓毒症休克的发展过程中，肺是最易受损的器官之一^[1]。急性肺损伤（acute lung injury， ALI）/急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome， ARDS）是临床上的危重症，病死率可高达30%～40%^[2]，其主要病理学特征是肺泡-毛细血管屏障受损导致血管外肺水增加和形成肺水肿。已有报道视血管外肺水为脓毒症患者病死率的独立预测指标^[3]，但针对ALI时肺水肿的治疗目前并无突破性进展。多巴酚丁胺（dobutamine）作为临床上常用的血管活性药物之一，近年来在内毒素等引起的急性肺损伤肺水肿方面的保护作用已引起广泛关注^[4-5]。本研究旨在观察不同剂量多巴酚丁胺对脓毒症休克兔ALI的影响，探讨其对肺损伤的可能保护机制。

1材料与方法

1.1动物分组及模型的制备

健康成年雄性新西兰大白兔70只，体质量2.0～2.5 kg，由南京医科大学附属南京医院动物实验中心提供。兔禁食24 h后称重，予20%乌拉坦1 g/kg麻醉后，右股静脉置管补液，左颈动脉插管测动脉压。参照全竹富等^[6]改进的盲肠结扎穿孔术联合静脉注入内毒素制备脓毒症休克模型。术后待血压稳定15 min后予以内毒素（LPS，血清型O55B5，购自美国SIGMA公司）600 μg/kg静脉推注，时间约15 min。平均动脉压降至基础值的60%视为达到休克标准。休克后随机（随机数字法）分成四组：①ALI模型组（B组，n=14）、多巴酚丁胺低剂量组（C组，n=14）、多巴酚丁胺中剂量组（D组，n=14）、多巴酚丁胺高剂量组（E组，n=14）。四组均以15mL/（kg·h）的速率输注林格液进行液体复苏，以平均动脉压维持至70 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）为准;②C组：液体复苏时持续输注多巴酚丁胺 2.5 μg/（kg·min）;③D组：液体复苏时持续输注多巴酚丁胺 5 μg/（kg·min）;④E组：液体复苏时持续输注多巴酚丁胺 10 μg/（kg·min）。另设假手术组（A组，n=14）：动物仅接受盲肠探查术。各组兔分别于3 h和6 h处死取材。

1.2检测指标及方法

1.2.1肺组织湿/干质量（W/D）比值的测定取左肺组织吸干血迹后称湿质量，再置入70 ℃烘箱48 h至恒重后称干质量，计算两者比值。

1.2.2肺组织环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate， cAMP）含量的测定取右肺下叶小块组织，常规匀浆、离心取上清液，采用ELISA法检测肺组织cAMP水平，操作步骤严格按照试剂盒（cAMP试剂盒购自美国NewEast公司）说明进行。

1.2.3Western-blot检测水通道蛋白5（Aquaporin 5， AQP5）按照试剂盒说明书提取肺组织蛋白，测定蛋白浓度后保存于-70 ℃冰箱待用。将待测样品行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜1 h，封闭1 h，加入多克隆羊抗AQP5（购自美国SantaCruz公司），孵育过夜，加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG（1∶1500， 购自南京凯基生物科技发展有限公司），孵育，ECL显影，曝光。采用Gel-Pro32软件进行灰度分析，目的蛋白与内参灰度比值即为目的蛋白的相对含量。

1.2.4肺组织病理学观察取右肺上叶小块组织，光镜下观察，并由2名以上病理医师以Guo等^[7]的方法对肺损伤的程度进行病理学评分。再取1 mm × 1 mm × 1 mm大小组织作电镜检查。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，各组数据以均数±标准差（x±s） 表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD法，方差不齐则进行秩和检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1各组肺组织W/D比值的变化

3 h、6 h时间点各组间W/D比值比较，差异具有统计学意义（F=10.94;F=20.49， P<0.01）。与A组相比， B组W/D比值在3 h和6 h均明显增加（P<0.05），且6 h W/D比值增加更明显（P<0.05）;与B组相比，3 h C、D 两组W/D比值无明显变化（P>0.05）， 3 h E组W/D比值显著降低（P<0.05），6 h D、E两组W/D比值均明显降低（P<0.05）;与C组比较，E组W/D比值亦明显降低（P<0.05）;D组和E组W/D比值差异无统计学意义（表1）。

2.2各组肺组织cAMP浓度的变化

3 h、6 h时间点各组间cAMP浓度比较，差异具有统计学意义（F=1168.49; F=1422.16， P<0.01）。与A组相比，B组cAMP浓度在3 h和6 h均明显下降（P<0.05）;与B组相比，C、D、E组cAMP浓度在3 h和6 h时间点均明显增加（P<0.05）;与C组相比，D、E两组cAMP浓度增加明显（P<0.05），且E组较D组cAMP浓度增加更明显（P<0.05）。

2.3各组肺组织AQP5蛋白量的变化

3 h、6 h时间点各组间AQP5蛋白量比较，差异具有统计学意义（F=90.19;F=83.32; P<0.01）。与A组相比，B组AQP5蛋白量在3 h明显减少（P<0.05），随着损伤时间延长， 6 h时减少更明显（P<0.05）;与B组相比，C组AQP5蛋白表达量在3 h时无明显改变，6 h时有所增加（P<0.05），D组和E组AQP5蛋白量在3 h和6 h时表达均明显增加（P<0.05）;与C组比较，D、E两组AQP5蛋白量亦有所增加（P<0.05），且E组较D组增加更明显（P<0.05）（图1）。

2.3各组肺组织AQP5蛋白量的变化

3 h、6 h时间点各组间AQP5蛋白量比较，差异具有统计学意义（F=90.19;F=83.32; P<0.01）。与A组相比，B组AQP5蛋白量在3 h明显减少（P<0.05），随着损伤时间延长， 6 h时减少更明显（P<0.05）;与B组相比，C组AQP5蛋白表达量在3 h时无明显改变，6 h时有所增加（P<0.05），D组和E组AQP5蛋白量在3 h和6 h时表达均明显增加（P<0.05）;与C组比较，D、E两组AQP5蛋白量亦有所增加（P<0.05），且E组较D组增加更明显（P<0.05）（图1）。

3讨论

目前普遍认为在ALI/ARDS的发展过程中，肺水肿起关键作用，且AQP5与肺水肿的形成密不可分。研究发现，在内毒素诱导的ALI模型中，多巴酚丁胺可通过上调AQP5的表达起减轻肺水肿的作用^[5]，但不同剂量多巴酚丁胺对AQP5的表达和肺水肿的影响差异具有统计学意义无统计学意义，国内外尚未见相关报道。

本实验成功复制兔急性肺损伤模型后，根据预实验结果及文献[4-5]，分别予多巴酚丁胺2.5、5.0和10 μg/（kg·min）三种剂量，观察其对ALI的影响。结果显示，B组光镜及电镜结果符合ALI 病理改变，肺组织病理评分及W/D比值明显升高，说明建立的ALI模型有效可行。给予多巴酚丁胺后，肺组织的病理损伤有不同程度的改善，病理学评分及W/D比值显著降低，且存在剂量依赖性，提示多巴酚丁胺可减轻肺组织的病理损害，对肺损伤起保护作用。

水通道蛋白是一种调节水进出细胞的特异性膜通道蛋白，参与多种病理生理过程。目前所知的水通道蛋白有4种存在于啮齿类动物的呼吸道，其中AQP5主要表达在AT I的顶膜^[8-9]。Ohinata等^[10]将小鼠AQP5基因敲除后发现肺泡-毛细血管屏障对水的渗透能力较野生型小鼠降低约10倍。谭利平等^[11]在高压氧所致的大鼠肺损伤模型中发现，随着高压氧的暴露时间延长，AQP5表达量逐渐减少，W/D比值逐渐增加。本实验通过western-blot检测肺组织中AQP5的表达变化，发现AQP5的表达量在造模成功后3 h即有明显下调，肺W/D比值则明显增加，提示在ALI发展过程中，AQP5表达水平下降可能是肺内液体在肺泡腔和肺间质聚集，形成肺水肿的重要原因。笔者还观察到，模型组中cAMP水平较正常对照组明显下降，这与Tang等^[12]研究结果相一致。在ALI的发展过程中，AQP5蛋白水平下调可能与LPS致伤后机体释放大量炎症介质，激活NF-κB和MAPK信号通路，从而降低AQP5的表达有关^[13-15]，但AQP5表达量下降是否与其被细胞吞噬有关，cAMP水平下降是否影响AQP5磷酸化水平还有待进一步研究。

β-肾上腺素能受体参与调节胞内诸如cAMP等第二信使的浓度，在各细胞和器官中起重要作用^[16]。通过β-肾上腺素能受体与G蛋白的偶联作用，β-肾上腺素能受体激动剂可激活腺苷酸环化酶，增加胞内cAMP的浓度^[17-18]。作为β-肾上腺素能受体信号传导通路的第二信使，cAMP可激活蛋白激酶A并使之磷酸化，进而对AQP5的表达进行调节。近年来的众多研究均表明，cAMP可上调AQP5的基因和蛋白的表达。Yang等^[19]将肺泡上皮细胞暴露于cAMP几小时后发现AQP5 mRNA和蛋白量均明显增加。Sidhaye等^[20]进一步研究发现cAMP对AQP5的表达具有双向调节的作用，短期（数分钟）暴露于cAMP后发现，小鼠肺泡上皮细胞膜上AQP5含量下降，长期持续暴露则AQP5含量明显增加。此外，还有研究发现，PKA诱导AQP5的苏氨酸256位点磷酸化这一过程是由cAMP信号途径介导的^[21]。通过本实验研究结果，笔者发现，给予多巴酚丁胺后，cAMP含量和AQP5的蛋白表达量均呈剂量依赖性增加，W/D比值则明显降低，提示多巴酚丁胺可能通过提高cAMP的水平上调AQP5的蛋白表达，从而促进肺泡及间质内液体的清除，减轻肺水肿，改善肺的病理损伤，对肺损伤起一定程度的保护作用。

综上所述，多巴酚丁胺能有效减轻内毒素致兔的急性肺损伤，其机制可能是通过提高胞内cAMP水平进而促进AQP5的蛋白表达实现的，且其保护作用呈剂量依赖性，从而为临床上急性肺损伤的治疗提供新的思路。

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（收稿日期：2014-07-17）

（本文编辑：何小军）

p1338-1343