消氨菌的分离、鉴定及其急性经口毒性

刘雪兰 魏祥法 董以雷 石天虹 阎佩佩 邱聪 张燕 伏春燕

摘要：为筛选出安全且能降低畜禽舍内氨气浓度的菌株，本研究从鸡粪、活性淤泥等6个样本中分离单一菌株，检测菌株的除氨效果，并对较优除氨功能的菌株进行鉴定和急性经口毒性试验。结果表明，分离到两株单一菌株，经检测其中一株具有较强除氨能力，初步鉴定该菌株属于金黄杆菌属（Chryseobacterium）;经急性经口毒性试验发现，菌液对小鼠半数致死量（LD50）大于20 g/kg BW，属实际无毒级;处理14 d后，小鼠血清中谷丙转氨酶（AST）、谷草转氨酶（ALT）、尿素（BUN）、肌酐（Cre）、血糖（GLU）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量与对照组均无显著性差异（P>0.05）。因此，该菌安全无毒副作用，可应用于畜禽养殖业有害气体的消除。

关键词：消氨菌;分离;鉴定;急性毒性

中图分类号：S432.4+2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2019）12-0082-05

Abstract The study was aimed to screen out bacteria strains which were safe and could reduce ammonia concentration in livestock and poultry houses. We isolated single strain from six samples including chicken manure， active sludge and so on， and tested their ammonia-removal effects. Then we selected the strain with better ammonia-removal effect and conducted the acute oral toxicity experiment. The results showed that two strains were isolated， and one of them had stronger ammonia-removal ability. It was preliminarily identified belonging to Chryseobacterium. The lethal dose （LD50） of the bacterial solution to mice was more than 20 g/kg BW， so it belonged to the actual non-toxic level. After 14 days of treatment， there were no significant differences in serum alanine aminotransferase （AST）， glutamic oxaloacetic aminotransferase （ALT）， urea （BUN）， creatinine （Cre）， blood glucose（GLU）， total cholesterol （TC） and triglyceride （TG） contents between experimental group and control group（P>0.05）. Hence， the bacterium was safe and non-toxic， which could be used to eliminate harmful gases in livestock and poultry industry.

Keywords Ammonia-removal bacteria; Isolation; Identification; Acute toxicity

在畜禽养殖过程中，粪尿中的尿酸、未被消化的蛋白质等在微生物的作用下会产生大量氨气，一方面对畜禽健康产生极大危害，导致生产性能下降，养殖效益降低;另一方面，也是大气PM 2.5指数持续升高的推手和引起雾霾天气的重要元凶，严重危害人类健康。如何消减畜禽养殖过程中产生的氨气是现代畜牧业生产的重要研究课题。饲料添加剂（酶制剂、脲酶抑制剂、酸化剂、微生态制剂等）能在一定程度上减少氨气的排放，但饲粮中的氮不可能完全被吸收，总有一部分排放出来，在微生物的作用下产生大量的氨气，因此末端治理技术研發成为必然。目前主要的方法有安装微电流抑菌抑氨系统、硫酸铵回收系统等，其缺点是投资过大，能量消耗过多，一般用于高附加值的祖父代种畜禽，不适合应用于商品代畜禽舍。生物除氨技术具有经济、高效的特点，已在污水处理等领域应用，在养殖业也取得了初步的进展，如单奇华[1]、张远琼[2]等分别筛选出的酵母菌和放线菌，用来处理畜禽粪便时均取得了很好的效果，适合应用于养殖废弃物处理环节。目前多采用吸附法和掩盖法，但其研究效果一般。受生物法处理养殖废弃物的启示，本试验拟从自然界中筛选出消氨菌，用于消除畜禽舍中的氨气，旨在改善畜禽舍环境、增进畜禽健康。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 A样品来自淄博马踏湖湖底污泥，B样品来自聊城污水处理厂的活性污泥，C样品来自山东省农业科学院家禽研究所鸡舍的新鲜鸡粪，D样品来自垃圾中转站污水，E样品来自使用后的发酵床垫料，F样品来自市售有机肥。

1.1.2 主要试剂和仪器

葡萄糖、（NH4）2SO4、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、琼脂粉、琼脂糖、LB培养基、纳氏试剂、酒石酸钾钠、NaCl、氢氧化钠（片状）、丙三醇、二甲基亚砜、无水乙醇、磷酸氢二钾等，均为国产分析纯试剂。电热恒温培养箱，购自山东致远试验设备有限公司;万分之一电子天平，购自上海力辰仪器科技有限公司;电热恒温振荡培养箱，购自常州市中贝仪器有限公司。

1.1.3 培养基

富集培养基：葡萄糖5.0 g，（NH4）2SO4 2.0 g，NaCl 2.0 g，FeSO4·7H2O 0.4 g，K2HPO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，去离子水1 000 mL，pH值7.2～7.4，121℃高压灭菌30 min。

分离培养基：富集培养基加2%琼脂。

筛选培养基：葡萄糖5.0 g，（NH4）2SO4  0.6 g，NaCl 1.0 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，K2HPO4  0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，去离子水定容至 1 000 mL，分装于 250 mL三角瓶中，每瓶 100 mL，121℃灭菌30 min。

1.2 菌株的分离、纯化

样品预处理：取上述样品各5 g分别溶解于100 mL无菌水中，于30℃、110 r/min 的恒温摇床中振荡混匀。

富集培养：将经过预处理的6个样品接种于装有100 mL灭菌的富集培养基中，充分摇匀，30℃、180 r/min富集培养，每隔1 d补充5%硫酸铵，富集7 d，以淘汰不能利用NH+4-N的微生物。

菌株的分离纯化：从培养7 d的发酵液中吸取1 mL能利用NH+4-N的富集样品，经梯度稀释（10-1 ～ 10-6）后，取0.1 mL的接种量涂布在倒置的分离培养基平板上，于30℃进行培养，挑取平板上长出的单菌落进行重复分离纯化，直到得到单一菌株。

1.3 消氨菌的筛选

将纯化得到的菌株接种到筛选培养基中，测试各菌株在30℃、180 r/min 条件下培养24、48 h后的NH+4-N去除率，从而筛选出消氨能力较强的菌株。

NH+4-N去除率（%）=（初始NH+4-N量-培养后NH+4-N量）/初始NH+4-N量×100。

1.4 菌株的鉴定

1.4.1 形态学鉴定

观察平板上生长的菌落形态特征，参照微生物学实验技术对分离出的菌株进行革兰氏染色并在光学显微镜下观察菌株形态。

1.4.2 分子生物学鉴定

提取消氨菌基因组DNA，以27F、1541R（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， 1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′） 为引物进行16S rRNA的扩增。PCR反应体系（25 μL）：2×Taq PCR mix 12.5 μL，ddH2O 8 μL，27F 1 μL，1541R 1 μL，DMSO 1.5 μL，离心混匀后加入 DNA 模板1 μL。PCR反应程序：95℃ 5 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 90 s，共35个循环;72℃ 10 min。取4 μL PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳（25 mL 1×TAE缓冲液，1%的凝胶，90 V，35 min）进行检测。DNA测序由山东力戈科技有限公司完成。DNA序列同源性采用NCBI（National Centre for Biotechnology）网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Blast软件进行检索，将搜索到的同源序列用Clustal X软件进行排序，然后用MEGA 6软件进行系统进化树构建。

1.4.3 生理生化鉴定

用法国梅里埃微生物鉴定系统进行鉴定，方法按照肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒说明书进行。

1.5 急性经口毒性试验

1.5.1 预试验 Horn氏法[3]：将生长期雄性昆明小鼠分为3组，每组6只，对各组小鼠采用相应剂量进行一次灌胃，灌胃剂量分别为0.1、1.0、10.0 g/kg BW，灌胃后密切观察24 h，看是否有毒性反应和死亡现象。

1.5.2 最大耐受量试验

取体重相近的生长期雄性昆明小鼠20只，试验组和对照组各10只，单笼饲养，逐只称重，试验期2周。具体方法：禁食4 h 后（禁食期间自由饮水），一次性给予小鼠20 g/kg BW的受试物，对照组一次性灌胃20 g/kg BW的无菌水，灌胃后禁食1 h，连续观察14 d，记录小鼠体征表现[4]、行為状况、中毒症状[5， 6]及死亡时间。灌胃14 d后分别取各处理小鼠，乙醚麻醉后断颈取血，分离血清，测血清中谷丙转氨酶（AST）、谷草转氨酶（ALT）、尿素（BUN）、肌酐（Cre）、血糖（GLU）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）[7-9]含量;解剖小鼠，检查小鼠胸、腹部各器官变化情况[10]。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化

对6个样品进行富集培养、梯度稀释（10-1 ～ 10-6）后涂布在倒置的分离培养基平板上，并反复分离纯化，分别从B样品和C样品中分离到单一菌株（图1）。

2.2 消氨菌的筛选

对B、C菌株进行氨氮去除率的测定，结果见表1。菌株B的氨氮去除率为负值，为产氨菌，不符合要求;菌株C具有较高的脱氨效率，为目标菌株。

2.3 菌株的鉴定

2.3.1 细菌形态学特征

菌落圆形，乳白色，易挑取，表面光滑，不透明，边缘整齐;显微镜下观察为杆状，无芽孢，无鞭毛。

2.3.2 菌株的分子生物学鉴定

菌株C的16S rRNA扩增片段大小约1 636 bp（图2）;将测序结果与GenBank上已登录的基因序列作比对，发现与金黄杆菌同源性最高，为99%;利用MEGA 6软件，将分离菌株与部分参考菌株基于16S rRNA序列构建系统发育树，如图3。

2.3.3 生理生化特征

如表2所示，C菌为革兰氏阴性杆菌，不具运动性，氧化酶阳性，硝酸盐还原试验阴性，明胶液化试验阳性。根据形态学及生理生化等指标，确定菌株C属于金黄杆菌属（Chryseobacterium）。

2.4 菌株C急性经口毒性

2.4.1 预试验结果

经观察，灌胃后未见任何毒性反应，也无一例死亡，小鼠生长和精神状况良好，进食、饮水、呼吸、排泄及各种生命活动均正常。

2.4.2 最大耐受量试验

喂养14 d后进行解剖，小鼠心、肝、脾、肺、肾、肠等脏器与对照组相比均无明显病变和差异。结果显示，试验小鼠对菌体最大耐受剂量大于20 g/kg BW，在现行急性经口毒性试验剂量分级中[11]，将小鼠口服LD50大于10 g/kg BW的受试物划分为实际无毒物质，故菌体属实际无毒物质。

灌胃后小鼠生理生化指标的变化情况也可反映菌液对小鼠脏器功能的影响[12]。由表3可知，经菌液灌胃处理14 d后，处理组小鼠血清中谷丙转氨酶（AST）、谷草转氨酶（ALT）、尿素（BUN）、肌酐（Cre）、血糖（GLU）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量与对照组无显著性差异（P>0.05）。

3 讨论

3.1 不同微生物的抑氨效果

Kim等[13]分离到一株除臭乳酸杆菌，厌氧条件下，作用于新鲜猪粪浆50 h后可使其中的NH3浓度降低98.5%以上。陈丽园等[14]分离到的菌株10MG可使新鲜猪粪中氨气排放量降低76.14%。陈国营等[15]从蛋鸡粪便中分离到一株乳酸片球菌属抑氨菌，其菌液96 h抑氨效果为40.0%。甘晓等[16]筛选到两株细菌YF1和YS2，分别为假单胞菌属 （Pseudomonas sp.）和中华根瘤菌属 （Sinorhizobium sp.），两菌1∶1混合接种到鸡粪中可使NH3释放量降低75.6%。本研究从新鲜鸡粪中分离到1株能够除NH+4-N的金黄杆菌属菌株，48 h对筛选培养基中的NH+4-N（229 mg/L）去除率为27.53%，与上述菌株有一定差距，这与菌株的种类、NH+4-N浓度、作用时间、其它基质的含量等不同有关，下一步将采用诱变方法或基因工程方法提高其NH+4-N去除效果。

3.2 抑氨微生物的安全性

畜禽养殖业产生的恶臭已成为一大公害，除臭微生物的筛选工作开始于二十世纪四五十年代，人们先后从不同的基质中分离到不同种类但具有相同功能的抑氨微生物，由于这些微生物最终应用于畜禽舍或畜禽粪污处理场，因此有必要对其进行安全性评价，特别是对一些条件致病菌。本研究筛选到的菌株C经形态观察、生理生化反应和分子鉴定发现与金黄杆菌同源性高达99%。金黄杆菌为条件致病菌，但同时又具有去除NH+4-N的功能，因此在养殖业中具有应用潜能。通过小鼠急性经口毒性试验证明其不具有毒性，采用最大剂量耐受法对小鼠一次性灌胃20 g/kg BW后，小鼠进食、饮水、呼吸、排泄及各种生命活动均正常，未出现任何毒性反应，也无一例死亡，表明该菌属于“实际无毒”级。灌胃处理14 d后测定小鼠血清中各项生理生化指标，均与对照组无显著性差异，说明处理组小鼠脏器功能未受影响。

4 结论

本研究分离出具有较强除氨能力的菌株C，并初步鉴定该菌株属于金黄杆菌属（Chryseobacterium）;通过急性经口毒性试验发现，菌株C不具有毒性，属于安全菌株，經过诱变育种、分子育种改良后，具有应用在养殖业生产中的潜力，也可以与现有的抑氨菌进行复配，应用于畜禽养殖环境的调控中。

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