半矮生型桃F—box基因的克隆和表达特征分析

王玉兰　鲁振华等

摘 要：
【目的】研究半矮生型桃‘SD9238F-box基因的序列特征及F-box基因在新梢生长跃变期的表达与节间伸长的关系，为进一步研究该基因调控半矮生型桃植株生长的分子机制奠定基础。【方法】利用基因克隆和RACE技术获得‘SD9238F-box基因的gDNA及cDNA序列，并分析该基因的序列特征。采用 qRT-PCR 分析该基因在新梢生长跃变期的表达水平。【结果】获得F-box基因gDNA全长3 650 bp，cDNA 全长1 936 bp， GeneBank登陆号为KF023192。该基因ORF长1 509 bp编码502个氨基酸，蛋白质分子质量55.984 kD。生物信息学分析表明，氨基酸序列具有F-box蛋白家族中LRR的结构特征，与蔷薇科中苹果和草莓的F-box基因同源，相似性达98%。QRT-PCR分析结果表明，F-box基因在节间生长跃变期表达量的动态变化与新梢节间的伸长速率动态变化趋势一致，其基因相对表达量在半矮生型桃中于节间生长跃变点5月22日达到最大值，为第一时期的9.4倍；
在普通型桃中同样于5月22日达到基因相对表达量的最大值，但只为第一时期的2.2倍。【结论】获得了‘SD9238新梢中F-box基因KF023192的序列全长，并明确了该基因的序列特征。对该基因在新梢生长过程的动态表达分析显示，KF023192可能参与了半矮生桃新梢节间生长的调控。

关键词：
半矮生型桃；

‘SD9238；

F-box；

基因克隆；

RACE；

qRT-PcR

中图分类号：S662.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0543-08

F-box蛋白因最初发现于细胞周期蛋白Cyclin F中而得名[1]，它广泛存在于真核生物中，拟南芥全基因组测序发现了1 000多个具有F-box结构域的蛋白[2]。它是一类含有F-box结构域的蛋白家族，基因大小为430～2 000 bp[3]。其N端通常含有一个由40～50个氨基酸组成的F-box基序，此外，在C端具有一些与蛋白-蛋白相互作用相关的二级结构，如亮氨酸拉链（LRR，Leucine-rich repeat）、WD-40 repeats、锌指结构等，这些蛋白结构域介导了底物的特异性识别。F-box蛋白作为SCF复合体的重要组分，与植物的生长素、赤霉素、乙烯及茉莉酸等植物激素的信号传导有关[4]。如植物中发现的F-box蛋白家族成员TIR1是SCF复合体组分，而SCF复合体SCFTIR通过参与生长素诱导的Aux/IAA蛋白降解，从而解除对ARF转录因子的抑制，进而调控植物的生长[5]。对拟南芥的GA不敏感型突变体gid2进行研究发现，F-box蛋白SLR1可能通过依赖于GA的磷酸化作用经SCF蛋白降解途径正向调控GA的信号传导[6]。此外，李莉等[7]通过对OsF-box基因的RNAi，利用表达载体转化水稻‘日本晴研究该基因在水稻中的功能，结果显示：
植株株高变矮，抽穗期延迟，但上部节间会继续长出叶片和高位分蘖。以上研究表明，F-box蛋白参与了植物的激素信号传导及形态建成等重要的生命活动，可能是调控植株生长的关键因子。

‘SD9238是中国农业科学院郑州果树研究所在育种圃杂种后代中发现的一个半矮生型桃突变体，其树体相对矮小，萌芽率、成枝率较低[8]。该突变体树体仅为普通型的1/2～1/3，节间较短，果枝粗壮而长度适中，年修剪量极小，是调控桃树树势，实现树体有限矮化的理想基因资源。‘SD9238早期生长缓慢，5月中旬开始进入快速生长期，与普通型桃同时期的持续快速生长截然不同。李钰婷等[9]采用cDNA-AFLP技术在半矮生型桃‘SD9238的生长跃变期分离得到了F-box的差异表达序列，该基因可能参与了植株的生长调节。因此研究‘SD9238F-box基因的序列信息及表达特征，可为确定该基因在‘SD9238节间生长调控中的作用，并为进一步解析其调控半矮生型植株节间的生长机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

以中国农业科学院郑州果树研究所桃育种圃保存的7 a生半矮生型桃‘SD9238及普通型桃的实生苗为供试材料。取‘SD9238新生叶片，液氮速冻后保存于-80 ℃备用；
并于2012年4月23日、5月6日、5月20日、5月22日、5月27日及6月8日取半矮及普通型桃当年生新梢茎尖，液氮速冻后保存于-80 ℃备用。

1.2 新生枝条生长动态测定

选取普通及‘SD9238各30个新生枝条为样本，分别于新梢茎尖的取样时期以及5月25日和6月12日，对新梢顶芽向下数第4节间进行节间长度测量，求平均值。

1.3 gDNA全长序列克隆

1.4 cDNA全长序列的克隆

桃茎尖总RNA的提取参考CTAB-LiCl法[11]，样品检测方法与gDNA相同。3′ RACE和5′ RACE cDNA的获得采用SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech），具体操作参照使用说明。其中5′ 端采用巢式扩增，以反转录获得的cDNA第1条链为模板，在获得片段的基础上设计引物，与5′ RACE巢式通用引物（NUP）进行5′ cDNA末端2次扩增。5′ RACE和3′ RACE cDNA扩增PCR程序：
94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 40 s，30个循环；
72 ℃终延伸10 min。目的片段的检测、回收、克隆、测序及序列的峰图矫正和拼接与gDNA中方法一致。

1.5 生长跃变期F-box基因的表达量分析

1.6 生物信息学分析

2 结果与分析

2.1 F-box基因结构及推导氨基酸序列分析

2.2 序列相似性及系统进化分析

2.3 生长跃变期F-box基因的表达特征

3 讨 论

本研究根据GDR数据库中桃基因组序列，对‘SD9238中的F-box基因KF023192进行了gDNA及cDNA序列的克隆。结果表明该序列与数据库的序列一致，无变异位点。但通过克隆该基因的全长cDNA序列发现，其ORF与GDR数据库中相比，5′ 端缺失681 bp（227个aa），没有明显的F-box结构域。序列比对结果表明该氨基酸序列与蓖麻、毛白杨以及葡萄等所获得的F-box氨基酸序列相似度达64%～67%，序列覆盖度达90%～100%。9个物种相似序列的系统发育树表明该序列与苹果中预测的F-box基因同源，相似达99%。同时氨基酸序列结构预测显示，序列具有F-box家族蛋白的LRR结构特征。并有研究结果表明，某些F-box蛋白的功能不是通过F-box结构域而发生的，即不存在F-box结构域与Skp1的相互作用时，F-box蛋白仍具有功能。如F-box蛋白Rca1是细胞分裂后期促进复合体（anaphase promoting complex/cyclosome， APC/C）的重要抑制物，它能阻止未成熟周期蛋白的降解，但敲除F-box结构域后Rca1对APC/C依然具有抑制作用[13]，表明Rca参与该过程并非通过F-box结构域作用而发生。与GDR数据库中生物信息学预测结果相比，本研究克隆所得F-box基因全长缺失681 bp，分析认为F-box家族蛋白的外显子存在不同的剪接模式，或者是GDR数据库中‘生物信息学的预测不准造成的，具体原因仍需进一步研究。

研究发现模式植物拟南芥中存在多种F-box蛋白，它们可能分别参与了信号传导、激素（如乙烯、赤霉素等）代谢途径以及生物钟调节等生命活动。拟南芥中的F-box蛋白基因HWS的缺失将导致植株过量生长；
而HWS基因过量表达时植株明显矮小[14]，表明该基因对其生长与发育的调控有重要作用。水稻多蘖型矮秆突变体中分离到的D3基因，编码的蛋白属于F-box中LRR蛋白家族，基因表达分析结果表明该基因与细胞死亡相关[15]。除此以外，棉花、小麦以及苹果上也有关于F-box基因的报道，分别与GA信号的传导、花粉自交不亲和有关[16]。对‘SD9238及普通型桃节间生长跃变期内F-box基因的表达特征分析表明，该基因表达水平的高低与节间生长快慢呈正相关，且‘SD9238中该基因表达量的增加倍数明显大于普通型桃，证明F-box基因可能是参与‘SD9238节间生长调控的关键基因。

本研究克隆了半矮生型桃‘SD9238的F-box基因，并分析了该基因的序列特征，同时研究表明该基因是参与调控‘SD9238节间伸长的关键因子。但F-box基因如何调控半矮生型植株节间伸长，进而影响植株高度的分子机制仍需进一步研究。

参考文献 References：

[1] RISSEEUW E P， DASKALCHUK T E， BANKS T W， LIU E， COTELESAGE J， HELLMANN H， ESTELLE M， SOMERS D E， CROSBY W L. Protein interaction analysis of SCF ubiquitin E3 ligase subunits from Arabidopsis[J]. Plant Journal，2003， 34：
753-767. [2] The Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana[J]. Nature， 2000， 408（6814）：
796-815.

[3] WANG Hong-yun， HUANG Jian， LAI Zhao， XUE Yong-biao. The F-box in plant and its research development[J]. Chinese Science Bulletin， 2002， 47（12）：
891-895.

王洪云，黄剑，赖钊，薛勇彪. 植物F-box蛋白质及其研究进展[J]. 科学通报，2002，47（12）：
891-895.

[4] BI Cai-li， LIU Xu， ZHANG Xue-yong. The function of F-box protein in plant growth and development[J]. Hereditas， 2006， 28（10）：
1337-1342.

秘彩莉，刘旭，张学勇. F-box 蛋白质在植物生长发育中的功能[J]. 遗传，2006，28（10）：
1337-1342.

[5] KEPINSKI S， LEYSER O. Auxin-induced SCFTIR1-Aux/IAA inter-action involves stable modification of the SCFTIR1 complex[J]. PANS， 2004， 101（33）：
12381-12386.

[6] SASAKI A， ITOH H， GOMI K， UEGUCHI-TANAKA M， ISHIYAMA K， KOBAYASHI M， JEONG D-H， AN G， KITANO H， ASHIKARI M， MATSUOKA M. Accumulation of phosphorylated repressor for gibberellin signaling in an F-box mutant[J]. Science， 2003， 21（299）：
1896-1898.

[7] LI Li， SONG Shu-feng， LI Yi-xing， FU Xi-qin. Preliminary study of OsF-box in race[J]. Hybridrice， 2011， 26（3）：
57-60.

李莉，宋书锋，李懿星，符习勤. 水稻OsF-box基因表达的初步研究[J]. 杂交水稻，2011，26（3）：
57-60.

[8] WANG Zhi-qiang， NIU Liang， LIU Shue，SONG Yin-hua， ZONG Xue-pu. ‘SD9238，A new semi-dwarft germplasm of nectarine[J]. Journal of Fruit Science， 2004， 21（5）：
503-504.

王志强，牛良，刘淑娥，宋银花，宗学普. 半矮化油桃新种质—SD9238[J]. 果树学报，2004，21（5）：
503-504.

[9] LI Yu-ting， LU Zhen-hua， NIU Liang， HAN Shi-ming， WANG Zhi-qiang. Preliminary investigation of differentially expressed genes using cDNA-AFLP approach during growth ramping of semi-dwarft peach[J]. Molecular Plant Breeding， 2011，9（1）：
91-96.

李钰婷，鲁振华，牛良，韩世明，王志强. 半矮生型桃生长跃变期差异表达基因的初步分析[J]. 分子植物育种，2011，9（1）：
91-96.

[10] BINBOIM H C， DOLY A J. Rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA[J]. Nuclleic Acids Research， 1979， 7（6）：
1513-1523.

[11] KSENIJAK G， HERNANDEZ A， KORBAN S S. RNA extraction from different apple tissues rich in polyphenols and polysaccarides for cDNA library construction[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2004， 12， 22（4）：
437-438.

[12] TONG Zhao-guo，GAO Zhi-hong，WANG Fei，ZHOU Jun，ZHANG Zhen. Selection of reliable reference genes for gene expression studies in peach using real-time PCR[J]. BMC Molecular Biology， 2009， 10：
71.

[13] SCHMIDT A， RAUH N R， NIGG E A， MAYER T U. Cytostatic factor：
an activity that puts the cell cycle on hold[J]. Cell Science，2006， 119（7）：
1213-1218.

[14] GONZALEZ-CARRANZA Z H， ROMPA U， PETERS J L， BHATT A M， WAGSTAFF C， STEAD A D， ROBERTS J A. HAWAIIAN SKIRT：
An F-box gene that regulates organ fusion and growth in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2007， 144（3）：
1370-1382.

[15] ISHIKAWA S， MAEKAWA M， ARITE T， ONISHI K， TAKAMURE I， KYOZUKA J. Suppression of tiller bud activity in tillering dwarf mutants of rice[J]. Plant Cell Physio1ogy，2005，46（1）：
79-86.

[16] YU Hai-chuan， WU Jiao， CUI Bai-ming. Cloning and expression analysis of two new genes encoding F-box proteins in cotton （Gossypium hirsutum L.）[J]. Cotton Science， 2008， 20（2）：
99-104.

于海川，吴 娇，崔百明，彭明. 棉花中两个新的F-box蛋白基因的克隆与表达分析[J]. 棉花学报，2008，20（2）：
99-104.