戴氏虫草活性成分分析及其对小鼠免疫功能的影响
时间：2021-05-05 07:52:16 来源：达达文档网 本文已影响 人 
摘要：分别采用苯酚硫酸法、高效液相色谱法（HPLC）测定了野生戴氏虫草的多糖、腺苷、甘露醇的含量；利用NIH小鼠进行碳廓清试验、免疫器官重量和迟发型超敏反应试验，通过急性毒性试验确定戴氏虫草水提液小鼠LD50。试验结果表明，野生戴氏虫草的多糖、腺苷及甘露醇含量分别为36.20 mg/g、0.27 mg/g和80.20 mg/g；戴氏虫草水提液能提高非特异性免疫功能，提高受环磷酰胺抑制的小鼠免疫器官重量和细胞免疫功能，其小鼠经口LD50>69.42 g/kg。
关键词：戴氏虫草；多糖；腺苷；甘露醇；碳廓清；细胞免疫功能
S567.35A
冬虫夏草［Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.］是我国传统的名贵中药材，具有独特的药用价值和广泛的药理作用，深受大众青睐，但由于野生资源极为有限，加上过度采挖，导致冬虫夏草产量逐年下降，价格极其昂贵。在虫草属中不同的虫草种类往往具有相似的化学成分和药理作用［1］，因此，寻找其它虫草资源作为冬虫夏草的替代品是缓解冬虫夏草资源压力的一条有效途径。戴氏虫草（C. taii Liang et Liu）于1991年在我国贵州首次被发现和报道［2］，随后相继在安徽、河南、湖南、广东等地均有发现。对戴氏虫草和冬虫夏草化学成分的研究表明，两者的氨基酸、维生素和微量元素等含量基本一致［3］，对戴氏虫草菌丝体的微量元素及氨基酸成分也有研究和报道［4，5］，药理研究发现其菌丝体提取物具有抗菌［6］、免疫调节［6~9］、抑制肿瘤细胞［10］等作用。本研究对野生戴氏虫草的主要活性物质进行分析，并与青海产冬虫夏草进行比较，同时研究其对小鼠非特异性免疫功能、免疫器官和细胞免疫功能的作用，为开发利用野生戴氏虫草提供依据。
1 材料与方法
1.1材料
戴氏虫草由广东金虫草生物开发有限公司提供，冬虫夏草购自广州同仁堂药房。
1.2试剂
葡萄糖、甘露醇由中国药品生物制品检定所提供；苯酚由北京鼎国生物技术有限责任公司提供；浓硫酸为广州化学试剂厂产品；腺苷为美国Sigma公司产品；环磷酰胺（CP）为上海华联制药有限公司产品；2，4-二硝基氯苯（dinitrochlorobenzene，DNCB）为东京化成工业株式会社产品；印度墨水为德国Chroma公司产品。
1.3仪器
日本岛津LC-20A高效液相色谱仪：配SPD-M20A二极管阵列检测器、RID-10A示差检测器、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱。瑞士产R200旋转真空干燥仪。755B型紫外可见分光光度计和FA2004N电子天平由上海精密科学仪器有限公司生产。
1.4实验动物
NIH小鼠，雌雄兼用，体重18～22 g，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2003-0002、粤监证字2004A018。
1.5活性成分的测定
1.5.1多糖含量的测定
称取烘干粉碎的戴氏虫草和冬虫夏草各10 g置于500 mL的圆底烧瓶中，加250 mL双蒸水，在恒温电热套上（80 ℃）浸提2 h后过滤，滤渣中再加入250 mL双蒸水提取2 h，过滤后合并滤液，减压浓缩后定容至100 mL，加入4倍体积的95%乙醇，静置过夜，离心弃上清液，沉淀用水定容至100 mL，采用苯酚硫酸法测定多糖含量［11］。
钟 韩，等：戴氏虫草活性成分分析及其对小鼠免疫功能的影响
1.5.2腺苷的测定［12］
称取烘干粉碎的戴氏虫草和冬虫夏草各0.25 g于25 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液定容，置超声波振荡器中振荡提取30 min，取上清液用0.45 μm滤膜过滤，滤液上HPLC分析。色谱条件为色谱柱：Shim pack-VP ODS（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：乙腈/水 = 7/93（V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：260 nm。
1.5.3甘露醇的测定［13］
称取烘干粉碎的戴氏虫草和冬虫夏草各2.0 g于50 mL离心管中，加入50%乙醇溶液30 mL，于超声波振荡器中超声30 min后，4355 ×g离心5 min，取上清液，残渣重复提取一次，合并上清液，浓缩后定容至25 mL，用0.45 μm滤膜过滤，滤液上HPLC分析。色谱条件为色谱柱：Shim pack-VP NH2（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：乙腈/水 = 4/1（V/V）；流速：2.0 mL/min；柱温：35 ℃。
1.6水提物的活性及急性毒性试验
1.6.1样品的处理
戴氏虫草洗净后在50 ℃下干燥，水煮提取2次，每次2 h，合并煮液浓缩至每毫升含生药2 g，为戴氏虫草水提液，于4 ℃保存，用前用蒸馏水配至所需浓度。
1.6.2动物分组
按随机方法对小鼠进行分组，每组12只，根据不同实验项目设置对照组和实验组数。
1.6.3碳廓清试验方法［14］
实验组戴氏虫草水提液按0.52、1.04、2.08、4.16、8.32 g生药/kg/d设置5组，灌胃给药，对照组用等体积蒸馏水，每天1次，连续7 d，末次给药1 h后，各组小鼠尾静脉注射印度墨汁10 mL/kg体重，注入墨汁2 min、15 min后用吸血管从小鼠眼眶静脉取血0.02 mL，立即吹入2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，以正常小鼠血0.02 mL溶于2 mL 0.1% Na2CO3中比色调零，于675 nm处测定吸光度，按下式计算廓清指数（K）。
K=LgOD1-LgOD2T2-T1
式中OD1：注入墨水后2 min的吸光度；OD2：注入墨水后15 min的吸光度；T2-T1：两次取血的时间差。
1.6.4对免疫器官重量影响的实验方法［14］
设正常对照组、环磷酰胺组、环磷酰胺+戴氏虫草水提液组（分2.08、4.16和8.32 g生药/kg/d三个组）。戴氏虫草水提液按剂量每天灌胃1次，连续7 d，给药第4天腹腔注射环磷酰胺1次(60 mg/kg)，对照组用等体积蒸馏水；末次给药1 h后，颈椎脱臼处死小鼠，取各组小鼠胸腺和脾脏，电子天平称重，计算胸腺指数和脾脏指数。
1.6.5迟发型超敏反应实验方法［14］
设正常对照组、戴氏虫草水提液2.08、4.16、8.32 g生药/kg /d剂量组，各组小鼠腹部去毛1 cm×2 cm，用1%DNCB 丙酮花生油溶液50 μL/只涂布于腹部皮肤致敏，试验组按剂量灌胃给药，对照组用等体积蒸馏水，每天1次，连续9 d，第8天用相同的DNCB溶液10 μL涂抹小鼠右耳两面进行攻击，24 h后处死小鼠，用0.8 cm打孔器打下左右耳片，电子天平称重，以左右两耳片重量之差为迟发型超敏反应值。
1.6.6急性毒性试验方法［15］
NIH小鼠20只，雌雄各半，给药前禁食不禁水，禁食12 h后灌服戴氏虫草水提液（1.157 g生药/mL）30 mL/kg，间隔6 h后按相同方法和剂量再次给药，合计给药量69.42 g生药/kg；给药后小鼠自由饮食，连续观察1周，记录小鼠活动状况及死亡数。
1.6.7数据处理
采用SPSS11.5软件对数据进行分析和组间t检验。
2 结果
2.1戴氏虫草与冬虫夏草主要活性成分
戴氏虫草与冬虫夏草的活性成分分析结果发现，戴氏虫草的腺苷、甘露醇含量分别为0.27 mg/g和80.2 mg/g，明显高于冬虫夏草（0.13 mg/g和44.25 mg/mg），两者的多糖含量比较接近，分别为36.20 mg/g和38.69 mg/g。
2.2戴氏虫草水提液对NIH小鼠碳廓清能力的影响
从表1可以看出，随着戴氏虫草水提液给药量的增加，小鼠碳廓清能力逐渐增强， 4.16和8.32 g生药/kg两个剂量组小鼠廓清指数K显著高于对照组（P<0.05或P<0.01），说明戴氏虫草对小鼠碳粒廓清能力有一定的促进作用，即能提高小鼠的非特异性免疫功能。
2.3戴氏虫草水提液抗免疫器官抑制剂的作用
从表2可以看出，与对照组比较，环磷酰胺模型组胸腺指数和脾脏指数均显著下降。与单用CP比较，通过灌胃戴氏虫草提取液， 2.08、4.16、8.32 g生药/kg剂量组的小鼠胸腺指数和脾脏指数均明显增大（P<0.05或P<0.01），使受免疫抑制剂环磷酰胺损伤和抑制的免疫器官重量得到部分恢复。
2.4戴氏虫草水提液对迟发型超敏反应的影响
1）与对照组比较，**P<0.01
2)数据为12只小鼠的平均值
1）Compared with control group, **P<0.01
2)Mean ± SD of 12 replicate mice
表3表明，各戴氏虫草水提液组的小鼠耳廓肿胀度显著大于对照组（P<0.01），说明戴氏虫草水提液能明显促进迟发型超敏反应，即能提高小鼠的细胞免疫功能。
2.5急性毒性试验结果
戴氏虫草水提液经口给药后小鼠活动减少，安静，个别有稀便现象，24 h后小鼠行为恢复正常，连续观察1周，小鼠无一死亡。处死解剖小鼠，肉眼观察小鼠各主要脏器均无明显改变，即戴氏虫草小鼠口服戴氏虫草水提液LD50＞69.42 g/kg。
3 讨论
冬虫夏草的化学成分比较复杂，除了虫草多糖外，现代药物研究表明虫草中还含有甘露醇、腺苷、腺嘌呤、尿苷、鸟苷、尿嘧啶、麦角甾醇、氨基酸、虫草素及微量元素、矿质元素等成分［16］。目前，受人们关注并在生产实践中分析检测的主要活性成分通常包括虫草多糖、甘露醇、腺苷、虫草素等。戴氏虫草寄生于低海拔地区的鳞翅目夜蛾科幼虫，国内不少地区均有发现，藏量较为丰富，在贵州民间早已将戴氏虫草作滋补强壮药用［3］，在有的地方还被当作“冬虫夏草”来药用［5］。人们对戴氏虫草子实体和菌丝体的氨基酸、微量元素等进行了研究，但对于其它活性成分的分析未见报道。本研究结果表明，野生戴氏虫草含有虫草多糖、腺苷、甘露醇等生物活性成分，并且其腺苷和甘露醇的含量高于冬虫夏草。
在药效方面，人们已对戴氏虫草菌丝体作了较多的研究，尤其是对促进免疫功能作用的研究，如戴氏虫草菌丝体能促进正常机体的细胞免疫功能和分泌一些细胞因子，而且能拮抗环磷酰胺的免疫抑制作用［17］，对电离辐射引起的免疫损伤具保护作用［18］。本文研究了野生戴氏虫草水提液对小鼠碳粒廓清能力、免疫器官重量以及迟发型超敏反应等三个方面的影响，结果表明，戴氏虫草水提液能在一定程度上修复环磷酰胺对免疫器官的损害，提高机体的非特异性和细胞免疫功能，从而表明戴氏虫草对免疫功能具有较明显的促进作用。此外，对戴氏虫草水提液的急性毒性试验结果表明，其小鼠经口LD50＞69.42 g/kg，按毒性分类属无毒级，说明食用是安全的。因此，药理学研究的结果提示了戴氏虫草替代冬虫夏草入药的可能性。
［1］ 粱宗琦. 我国虫草属真菌研究开发的现状及思考［J］. 食用菌学报，2001，8（2）：53-62．
［2］ 梁宗琦，刘爱英，刘杰麟. 虫草一新种及其绿僵菌无性型［J］. 真菌学报，1991，10（4）：257-262．
［3］ 郭锡勇，郭莉莉，陈 芳. 戴氏虫草与冬虫夏草的化学成分比较［J］. 中药材，1995，18（8）：403-404．
［4］ 焦彦朝，刘杰麟. 无性型戴氏虫草和粉被虫草营养成分的分析［J］. 营养学报，2000，22（4）：347-348．
［5］ 李学梅，李用芳. 戴氏虫草菌丝体的培养及成分测定［J］. 河南农业科学，2003，12：44-46．
［6］ 焦彦朝，粱宗琦. 戴氏虫草无性型的研究—Ⅰ.抗生素［J］. 西南农业学报，1992，5（4）：46-48．
［7］ 焦彦朝，粱宗琦，刘爱英. 戴氏虫草无性型的研究：Ⅱ多糖［J］. 西南农业学报，1993，6（1）：27-32．
［8］ 刘杰麟，费 樱. 戴氏虫草和粉被虫草多糖对巨噬细胞等活性的影响［J］. 免疫学杂志，2001，17（3）：189-191．
［9］ 程 萍，刘若英，刘杰麟. 戴氏绿僵菌提取物对小鼠免疫调节活性的初探［J］. 贵阳医药，2005，29（11）：971-972．
［10］ 程 萍，刘若英，刘杰麟. 戴氏虫草对人喉鳞癌细胞生长抑制与凋亡诱导作用［J］. 陕西医学杂志，2007，36（6）：643-644，679．
［11］ 陶美华，潘清灵，章卫民. 药用真菌多糖含量测定方法研究［J］. 中国食用菌，2005，24（5）：37-38．
［12］ 马丽颖，张 铭，李润文，等. 人工蛹虫草子实体中虫草素的含量测定［J］. 辽宁中医杂志，1998，25（10）：489．
［13］ 董方霆，廖 杰. HPLC分析天然及人工培殖冬虫夏草菌丝体中的甘露醇［J］. 药物分析杂志，1998，18（增刊）：124-125．
［14］ 李仪奎.中药药理实验方法学［M］.上海：上海科学技术出版社，1991.
［15］ 陈 奇.中药药理学研究方法［M］.北京：人民卫生出版社，1993.
［16］ 阴 健. 中药现代研究与临床应用［M］. 北京:学苑出版社，1993：227．
［17］LIU JL. Enhancement of Cordyceps polysaccharide on immunologic function in vitro［C］. Advanced Course and Symposium in Immunology,Beijing,1996：153-156.
［18］ 刘杰麟，查筑红. 戴氏虫草菌丝体水提物对γ射线损伤小鼠免疫功能作用［J］. 中华放射医学与免疫杂志，2002，22（2）：109-110．
朱丽娜
