一种红菜薹新病害的病原鉴定及生物学特性研究
时间：2020-10-28 07:59:45 来源：达达文档网 本文已影响 人 
摘要：2010-2011年在湖北省红菜薹（Brassica campestris L. ssp. chinensis L.var. utilis Tsen et Lee）栽培中发现一种新病害，并从该红菜薹新病害发病叶片分离得到了病原菌hctyk1，观察该病原菌的孢子形态，分析了病原菌的ITS序列，研究了病原菌的生物學特性。结果表明，该病原菌为链格孢[Alternaria alternata（Fr.：Fr.） Keissler]，病原菌rDNA-ITS区序列已在GenBank上登录（登录号：JQ885954）。该菌菌丝生长致死温度为50 ℃；适宜pH为8；在供试的几种碳源、氮源中，最适的碳源是葡萄糖，最适的氮源是酵母浸出液。
关键词：红菜薹（Brassica campestris L. ssp. chinensis L.var. utilis Tsen et Lee）；新病害；ITS序列；病原菌
中图分类号：S634.6：Q93-331 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6442-03
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.029
红菜薹（Brassica campestris L. ssp. chinensis L.var. utilis Tsen et Lee）又名紫菜薹、芸薹、紫菘等，是十字花科（Brassicaceae）芸薹属（Brassica L.）的一个变种，是中国特有的蔬菜。由于红菜薹口感甚佳、肉质脆甜爽口、营养丰富而得到广大消费者的喜爱，种植面积连年扩大。2010-2011年，作者在湖北省长阳县、利川市等地的红菜薹高山栽培基地调查中，发现了一种新的红菜薹病害，该病染病初期多数叶片叶缘失绿，随着病情发展叶缘焦枯，并由叶缘沿叶脉向基部扩展，出现叶脉、叶柄失绿和叶片枯黄状况，一般发病率达10%～30%，严重削弱了红菜薹的长势，降低了产量和品质，影响了农民的收入。为确定该病病原并建立有效的防治方法，作者结合形态鉴定及基因组ITS区序列分析技术，对该病害的病原菌及其生物学特性进行了探讨，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 菌株的分离、纯化
2010-2011年从长阳县、利川市等地的高山红菜薹生产基地采集新病害病叶标本，在湖北省农业科学院经济作物研究所实验室采用常规组织分离法[1]分离菌株，分离菌株接种到马铃薯琼脂培养基（PSA）上，长出菌落后，挑取单一菌落的少量菌丝，移植到PSA平板，纯化培养；纯化后菌株编号为hctyk1。
1.2 致病性测定
根据柯赫氏法则[2]进行寄主活体接种，在湖北省农业科学院经济作物研究所南湖试验基地红菜薹播种19 d后，用hctyk1孢子悬浮液105个/mL喷雾方法接种，以清水为空白对照，3次重复。等田间出现相同的症状后再次分离，并将2次获得的分离菌作比较，以确定该菌的身份惟一性。
1.3 病原菌生物学特性测定
1.3.1 酸碱度试验 在湖北省农业科学院经济作物研究所实验室完成，设PSA培养基pH分别为4、5、6、7、8、9、10、11，共8个梯度，将直径为5 mm的hctyk1菌丝块移到PSA平板中央，平板置于28 ℃条件下培养3 d，然后十字交叉法测量菌落直径，每处理重复3次。
1.3.2 致死温度试验 设35、40、45、50、55 ℃ 5个处理温度，每个处理重复6次，将hctyk1菌丝块置于PSA平板中央，在恒温水浴锅中加热15 min后迅速冷却至室温，再于25±1 ℃下培养3 d后检查菌丝生长情况。
1.3.3 营养条件试验 基础培养基采用査彼（Czapek）培养基，配方是硝酸钠2 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、磷酸氢二钾1.0 g、硫酸镁0.5 g、蔗糖30 g、琼脂17 g，加去离子水1 L。碳源分别用葡萄糖、D-果糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖替代基础培养基中的碳源；氮源分别用甘氨酸、酵母浸出液、硫酸铵、硝酸钾、蛋白胨、磷酸二氢铵、硝酸铵和L-谷氨酸钠替代基础培养基中的氮源。在28 ℃条件下接hctyk1培养3 d，然后十字交叉法测量菌落直径，每处理重复3次。
1.4 病原菌rDNA-ITS PCR扩增和序列分析
将hctyk1菌块移至PSA平板上，28 ℃黑暗条件下培养48～72 h，然后将菌落边缘的菌丝切成2～3 mm的小块，把4～5块菌丝块移至马铃薯蔗糖液体培养基里，28 ℃、120 r/min振荡培养3～4 d。将液体培养好的病菌菌丝在双层尼龙网上过滤，用去离子水洗涤2次，以除去菌丝内的培养液；收集菌丝，将其包好放在硅胶中过夜，吸干水分；使用液氮研磨成粉末；用CTAB法提取DNA[3]。hctyk1病原菌rDNA的ITS区域PCR扩增引物分别为ITS-F和ITS-R，其碱基序列如下[4]：ITS-F（5′-GTCCTAAC AAGGTTTCCGTA-3′，AJ297952），ITS-R（5′-TTCTC CGCTTATTGATATGC-3′，AJ297953）。将PCR扩增产物回收、连接、转化，阳性克隆送华大基因测序公司测序。将测得的基因序列在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行BLAST比对，并上传至GenBank。
1.5 数据处理
试验所得数据采用Microsoft Office Excel 2003软件处理，并用其绘图，运用SPSS 13.0统计分析软件进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 病原菌形态和致病性
hctyk1病原菌分离、纯化情况见图1。从图1-a可见，病原菌产生了大量褐色的菌丝；图1-b显示，分生孢子梗深色，合轴式延伸，分生孢子淡褐色至深褐色，砖隔状。
田间接种后致病情况见图2。观察记载表明，在菌悬液喷雾接种的第七天，红菜薹植株开始出现症状，与在长阳县、利川市的田间症状相同，叶缘开始失绿，然后焦枯。并且从回接表现症状的病叶中再次分離到病原菌。
2.2 病原菌生物学特性
2.2.1 酸碱度 pH对hctyk1菌丝生长的影响情况见图3。从图3可见，hctyk1在基质中pH 4～11范围均可生长，其中又以在基质中pH 6～9的生长最好，此时菌丝生长扩展快，致密浓厚，表明微碱性培养基质较适合hctyk1的生长。
2.2.2 温度 温度对hctyk1菌丝生长的影响情况见图4。从图4可见，hctyk1的生长适宜温度在35 ℃左右，致死温度是50 ℃。
2.2.3 营养条件 营养条件对hctyk1生长的影响情况见图5、图6。从图5、图6可见，不同营养条件对hctyk1生长的影响差异较大。综合分析hctyk1菌丝扩展及菌丝生长量情况，适合hctyk1生长的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母提取物。
2.4 病原菌的rDNA-ITS序列验证
hctyk1病菌PCR扩增产物的电泳情况见图7。从图7可见，ITS-F和ITS-R从hctyk1基因组DNA中扩增出一条大小约为600 bp的片段，测序结果表明，hctyk1的rDNA-ITS区大小为534 bp；将该序列在GenBank上登录，登录号为JQ885954；然后将测得的序列在GenBank里进行BLAST分析。结果表明，所测序列与链格孢[Alternaria alternata（Fr.：Fr.）Keissler]的同源性为99%，证明引起该新病害的病原菌为链格孢。
3 小结与讨论
试验探讨的红菜薹新病害是在湖北省首次发现的一种真菌病害，该病在发病初期从叶片叶缘开始失绿，随着病情发展叶缘逐渐焦枯，并由叶缘沿叶脉向基部扩展；后期叶脉、叶柄失绿枯黄。试验结合形态学及分子生物学的方法，根据文献[5]，鉴定该病的病原菌为链格孢；链格孢可以引起落葵叶斑病、烟草赤心病、梨黑斑病等，但未见其在红菜薹上危害的报道。
生物学特性研究表明，该红菜薹新病害病菌致死温度是50 ℃，最适pH是8，最适碳源是葡萄糖，最适氮源是酵母浸出液；适宜生长温度为25～30 ℃。因此，在不影响红菜薹生长的情况下，通过适当调节环境的温度或者pH，对病情将能起到一定的控制作用，也为病害综合防治提供了有益的理论依据。但该红菜薹新病害病菌源自何方，传播媒介是什么，目前尚未找到，这将是下一步深入探讨的问题。
参考文献：
[1] 方中达.植病研究方法[M].第三版.北京：中国农业出版社，1998.
[2] 谢联辉.普通植物病理学[M].北京：科学出版社，2006.
[3] KNAPP J E，CHANDLEE J M. RNA/DNA mini prep from a single sample of orchid tissue[J]. Biotechniques，1996，21：54-56.
[4] JUNG D S，NA Y J，RYU K H. Phylogenic analysis of Alternaria brassicicola producing bioactive metabolites[J]. J Microbiol，2002，40：289-294.
[5] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.
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