木香、川木香、土木香、青木香和红木香药材的ITS2条形码分子鉴定
时间：2021-04-23 07:59:46 来源：达达文档网 本文已影响 人 
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[摘要]通过分析木香、川木香、土木香、青木香、红木香药材的ITS2 （internal transcribed spacer 2）条形码序列，探讨木香类药材鉴定新方法。对60份样品提取基因组DNA，PCR扩增ITS2序列并进行双向测序，所得序列经CodonCode Aligner拼接后，采用 MEGA5.0 软件进行序列比对，计算种内和种间遗传距离（K2P），构建邻接树（neighbor-joing tree，NJ Tree）。结果表明，无论是菊科的木香、川木香、土木香，还是马兜铃科的青木香和五味子科的红木香，ITS2序列种内变异均小于种间变异，ITS2序列所有单倍型比对后长度为272 bp，变异位点达到162个；遗传距离显示物种种内平均K2P远远小于种间平均K2P；NJ树结果显示木香、川木香、土木香、青木香和红木香药材可明显区分，且能鉴别川木香的2个基原物种。因此，ITS2序列可用于鉴定木香、川木香、土木香、青木香、红木香药材，为临床安全用药提供依据。
[关键词]DNA条形码；物种鉴定；ITS2 序列；菊科；马兜铃科；五味子科
木香、川木香、土木香、青木香、红木香5种木香类药材由于药材外形、气味、功效相似或者存在同名异物或同物异名等原因容易混淆，造成鉴定困难，但是这5种木香药材来源于不同的基原植物，木香Aucklandiae Radix为菊科Asteraceae植物木香Aucklandia lappa Decne.的干燥根，又称为广木香或云木香；川木香Vladimiriae Radix为菊科植物川木香Vladimiria souliei （Franch.） Ling、灰毛川木香V. souliei （Franch.） Ling var. cinerea Ling的干燥根；土木香Inulae Radix为菊科植物土木香Inula helenium Ling.的干燥根，又称为青木香或祁木香；青木香Aristolochiae Radix为马兜铃科Aristolochiaceae植物马兜铃Aristolochia debilis Sieb.et Zucc.的干燥根；红木香Kadsurae Radix为五味子科Schisandraceae植物南五味子Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep.的干燥根，又称土木香[1-3]。
木香类药材用药历史悠久，但5种木香类药材出现混用、替代，造成市场上木香类药材混乱。木香是常用药材，从梁代开始经广州进口的舶来品，称广木香，因其质量较优，逐渐成为主流品种。后在云南引种成功，称云木香，是现存木香药材的主流品种[4]，具有行气止痛、健脾消食的功效 [1]。现代药理研究表明木香对消化系统、心血管系统、呼吸系统以及多种肿瘤细胞有确切的疗效[5-9]。川木香是原产我国的道地药材，主产于四川西部，曾是木香的代用品和地方习用品[3-4]。川木香药材的功效与木香相似但侧重不同，药典中单独收载，应区别应用。但是川木香、灰毛川木香与木香主要有效成分均为去氢木香内酯、木香烃内酯，研究表明三者的指纹图谱，气相色谱相似度很高[10-13]，不易区分。Shum等[14]也通过GS-MS分析木香、川木香和灰毛川木香等物种挥发油成分，聚类分析表明可以区分木香与混伪品，但检测方法复杂，且无法区分川木香和灰毛川木香。土木香也曾作为木香的代用品[3-4]，土木香与木香的化学成分差异较大，其主要药效成分为土木香内酯和异土木香内酯，具有健脾和胃、行气止痛、安胎的功效[1]，现已取代马兜铃科青木香。2010年版《中国药典》仅收载木香、川木香、土木香3种木香类药材，其他的木香类药材已不予收载。青木香起始作为木香代用品种出现[4]，但现代研究表明马兜铃科植物中含有马兜铃酸，能引起肾毒性不良反应[15-16]，已于2004年取消青木香药品标准，凡中成药处方中含有青木香的药材将用土木香I. helenium L.干燥根代替。红木香是木香的混淆品，性味功能与木香差异大，性温、味辛，有行气、活血、止痛的功效[3]。总的来说，木香类药材原始品种、地方习用品、代用品和混淆品种类繁多，情况复杂，通过传统方法鉴定或化学成分检测不能很好的进行区分，不利于木香类药材规范化安全用药，需要寻找一种快速、准确的分子鉴定方法，以确保临床安全用药。
DNA条形码技术具有较强通用性，作为物种鉴定新手段，倍受国内外研究者关注[17-23]，目前，DNA条形码分子鉴定指导原则已经获准纳入《中国药典》2010年增补本[24]。Chen等[25]提出ITS2 序列可以作为标准DNA条形码鉴别药用植物及其近缘物种。ITS2片段具有适合扩增和测序的长度，在物种水平的变异较快，有更多的突变位点以区分不同的物种，因此，在DNA条形码鉴定物种方面具有潜在的研究价值。Yao等[26]基于大样本量分析证实ITS2 序列可以作为植物物种鉴别的通用条形码。本文应用ITS2序列对5种木香药材进行鉴定，为临床安全用药提供依据。
1 材料
木香药材样品（根）来源于云南、四川、西藏，包括药材市场购买、药店购买、野生采挖共20份；叶片样品1份，来源于云南。川木香药材样品（根）6份，灰毛川木香药材样品（根）16份，来源于主产区四川，包括野生采挖、药材市场购买；川木香叶片样品1份，来源于中国医学科学院药用植物研究所1961年标本，灰毛川木香叶片样品1份，来源于中国医学科学院药用植物研究所1974年标本；土木香药材样品（根）11份，来源于西藏，包括药材市场购买、野生采挖；叶片样品1份，来源于河南南阳。马兜铃药材样品（根）2份，来源于江西；叶片样品1份，来源于四川成都；木香3条ITS2序列，南五味子3条ITS2序列均由GenBank 下载的ITS 序列剪切而来。研究样本经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员和成都中医药大学国锦林教授鉴定，凭证标本保存于中国医学科学院药用植物研究所。实验材料详见表1。
