阻断一侧颈总动脉血流_蛛丝对股动脉血流亚急性阻断作用的研究

　　摘 要：目的：研究尝试以蛛丝为新材料探索建立亚急性缺血模型的制作方法。方法：在蛛丝结扎实验中分离大鼠股动脉后，将蛛丝缠绕股动脉10周，最终形成2mm长的结扎点，建立亚急性血管阻塞模型，同时监测造模血管的血流量、血压等生理指标与血清中氧化修饰蛋白（oxidatively modified proteins, OMP）含量等生化指标，并在造模的第1、3、5、7、10天分别进行大鼠股动脉取材、切片及HE染色，观察在造模后不同时间点模型血管的阻断程度。结果：在蛛丝结扎实验中笔者观察到，蛛丝结扎后大鼠股动脉的血流量、收缩压和舒张压总体表现出亚急性下降的趋势，模型大鼠的血清OMP在结扎后首先明显升高，随后又缓慢下降，HE染色发现蛛丝对股动脉的作用过程是一个从部分阻断直至完全阻断的渐进过程。结论：利用蛛丝的缓慢结扎作用可以建立中小血管的亚急性阻断模型，未来有可能将其应用于建立慢性缺血性心脑血管疾病模型。
　　关键词：蛛丝； 亚急性缺血； 动物模型
　　中图分类号：R285.5
　　文献标识码：A文章编号：
　　1673-7717（2008）05-0901-04
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　　Subacute Bloodstream Blockade Effect by Supercontraction of Spider Silk
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　　LI Lian�da�1,ZHOU Xiao�hui�2,WU Li�mao�2,HAN Lei�3,LI Yi�kui�1,WANG Wei�2�
　　（1.Xiyuan Hospital,Chinese Academy of Chinese Medical Science,Beijing 100091,China;�
　　2.Pharmacy College of Zhejiang Chinese Medical University,Huangzhou 310058,Zhejiang,China;�
　　3.Pharmacy College of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 106600,Liaoning,China
　　）
　　Abstract：�Objective�:The present study tried to make a new models of subacute ischemic disease by new material-spider silk. �Methods�: Femoral artery of rats was blocked with spider silk to set up the subacute ischemic model. Observation on ligated femoral artery lasted 10 days. Blood flow, systolic /diastolic blood pressure and oxidatively modified proteins in serum were measured before and after ligation. Meanwhile, histological manifestations of femoral artery at different times were observed by HE stain. �Results�:We found that blood flow, systolic /diastolic blood pressure of femoral artery showed a descent tendency. Biochemical assay showed that oxidatively modified proteins significantly increased in the first three days and reached peak on the 3rd day. Histological examination demonstrated that there was a progressive procedure from partial to complete occlusion of lumen of blood vessel and there was possibility of recanalization at last in the occlusive vessel. �Conclusion�:All the results showed that ligation by spider silk might be applied to models of subacute ischemic disease such as subacute femoral artery ischemia.
　　
　　Keywords：spider silk; subacute ischemia; animal model
　　局部缺血，即局部区域血流供应不足，可由多种因素引起（如血管腔内阻塞、腔外组织压迫、血管痉挛等），可以导致局部组织氧气和营养物质供应不足，从而引发一系列病理表现[1]，很多疾病如心肌缺血、糖尿病型小血管病以及Buerger’s综合征等均由此引发。近几十年来，局部血管急性阻断一直是建立局部缺血模型最常用的造模方法。但是，目前通常使用的丝线结扎法是一种急性实验方法，它所建立的模型用于评价慢性或亚急性等渐进性发展疾病并不是很理想。
　　 蜘蛛，节肢动物，蛛形纲，蜘蛛目动物的统称。有3.5万多种，遍布于全世界。蜘蛛丝做为一种天然动物蛋白纤维具有特殊的蛋白质二级结构，该结构决定了其具有特殊的生物力学特性。蜘蛛丝纤维是自然界力学性能最优良的天然纤维蛋白，所具有的强固性、柔韧性和生物相容性是其他人造纤维材料所无法比拟的，蛛丝具有比钢丝更大的抗拉强度，与防弹材料Kevlar有着相同的数量级强度。由于其独特的机械性能、良好的生物相容性和缓慢的可降解性,使其成为近年来组织工程研究领域十分感兴趣的一类特殊生物材料[2]，在组织工程支架及固缩材料上表现出极大的应用潜力。此外，蛛丝如果与水充分接触，将会收缩至原长度的50%，同时其机械特性亦会发生显著改变，即强度下降但弹性却渐进性增强，这种现象被称为“超收缩现象”，已有学者[3]对超收缩现象的分子结构变化机制进行了比较深入的研究。正是由于蛛丝这种渐进性增强的弹性变化，决定了其有可能用于建立慢性或亚急性的局部缺血性疾病模型。
　　由此，笔者想到了采用具有超收缩特性的蛛丝为材料来结扎动脉血管，模拟冠脉的慢性缺血过程，从而为未来进一步将蛛丝应用于制作慢性心肌缺血动物模型，进而动态观察其病理过程并进行机理研究打下基础。本研究的最终目标是将蛛丝或人造蛛丝开发研制成为冠心病心肌缺血动物造模中所需的新型生物材料。
　　蜘蛛的种类很多，大腹圆蜘蛛是比较常见的一种，加之其产丝的腹囊较大，产丝量较大，因此，本实验研究中以大腹圆蜘蛛作为选用的蜘蛛品种。蛛丝的种类很多，收缩性最强的一般认为是蜘蛛拖丝[4-8]，所以，在本实验研究中，笔者应用大腹圆蜘蛛的拖丝探索了制作SD大鼠亚急性后肢缺血模型的方法。 �
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　1 材料与方法 �
　　1.1 实验动物与实验准备
　　30只成年雄性SD大鼠平均体重（180±30）g随机分成两组，对照组10只，模型组20只。按动物实验室标准条件［温度（23±2）℃；相对湿度（65±2）%；12h昼夜循环］饲养动物。标准动物饲料喂养，任意饮水。本实验中所用的SD大鼠购于浙江省医学科学院实验动物中心。实验用大腹圆蜘蛛（体重95～190mg）捕捉于杭州植物园，由浙江大学昆虫研究所鉴定。 �
　　1.2 动物模型的制作
　　在造模手术之前，在室温（23±2）℃和相对湿度（25±2）%条件下，用10cm×10cm的小塑料框架从5只大腹圆蜘蛛尾部将蛛丝盘绕下来，转动速度为1cm/s，该速度与蜘蛛在自然状态下吐丝结网的速度近似[9]。将10cm蜘蛛拖丝折叠5次而成一段2cm结扎用丝，备用。 大鼠在手术前晚禁食8h，手术当日采用45mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射给药。大鼠麻醉后于左后肢内侧皮肤切开一纵向切口，分离股动脉两侧伴行的股静脉及神经，彻底暴露股动脉。将蛛丝以适当的力度缠绕于造模组大鼠股动脉共10周，最终形成2mm长的结扎点。对照组大鼠暴露股动脉但不进行结扎操作。术后缝合切口并消毒，肌肉注射青霉素(25万U•kg��-1�•d��-1�)，从手术当日起连续注射3天。 �
　　1.3 血流量 收缩压和舒张压的测量
　　于术前、结扎即刻、结扎后1、2、3、5、10、20、30min采用Biopac多导生理记录仪（型号:MP-150，美国Biopac system公司）及超声多普勒探头(型号:CBI-202，美国Triton Technology公司)记录股动脉血流。将连接换能器的探针插入股动脉结扎点远心端10mm处，测定股动脉压力。测量完毕拔出探针后，出血点用凝胶海绵压迫止血。 �
　　1.4 血清OMP的生化测定
　　于术前、手术即刻、术后1、2、3、5日尾静脉取血，测定血清OMP含量。其生化测定方法参照相关文献[10-13]。血清中蛋白质浓度的测定则运用Lowry蛋白质定量法[14-16]。结果以nmol OMP/mg 蛋白质含量来表示。
　　
　　1.5 组织化学染色
　　在造模手术后的第1、3、5、7、10天，每次随机选取6只大鼠（对照组2只，模型组4只），戊巴比妥钠麻醉，切除结扎的后肢，立刻放入福尔马林溶液中静置24h。乙醇脱水，二甲苯清洗后用石蜡包埋，10μm切片，HE染色。 �
　　1.6 统计学处理
　　所有实验数据均以�±s�表示,数据统计采用SPSS �13.0�统计软件包行ONE-WAY ANOVA分析。 �
　　2 结 果 �
　　2.1 蛛丝结扎股动脉所产生的阻断效果
　　见图1。可以观察到用蛛丝结扎大鼠股动脉后，股动脉的血流逐渐减少、血栓形成以及机化的过程。
　　
　　A.结扎前；B.结扎即刻；C.结扎后3h；D.结扎后1天；E. 结扎后3天；F.结扎后5天；G.结扎后7天；H.结扎后10天。各图中，箭头1所示的均为蛛丝结扎部位，箭头2所示的均为近心端，箭头3所示的均是远心端。 以上各图显示了蛛丝结扎股动脉所产生的渐进过程与最终结果。 图A为未结扎股动脉，箭头1所示的为预期结扎部位。图B中股动脉刚刚被结扎，箭头1所示的是股动脉被蛛丝缠绕的部位。图C是结扎后3h的股动脉，从图中可看出，股动脉结扎部位下游，血流量明显减少，但仍有部分血流通过。图D 是结扎后1天的股动脉。在它的结扎部位下游，已经基本观察不到血流。图E～H中，结扎部位上端血栓慢慢形成，结扎部位下游已经检测不到任何血流。图G中在结扎点的上端，形成了一个明显的已经凝固了的血栓。图H显示，手术后第10天。�
　　图1 蛛丝结扎股动脉所产生的阻断效果 �
　　2.2 模型大鼠股动脉血流量
　　见图2。可以观察到用蛛丝结扎大鼠股动脉后的30min内，大鼠股动脉的血流量表现为缓慢的渐进性下降过程。
　　
　　蛛丝结扎30min内，大鼠股动脉的血流量�表现为缓慢的渐进性下降过程。�
　　图2 模型大鼠股动脉血流量变化曲线（�n�=10）�
　　2.3 模型大鼠股动脉收缩压和舒张压
　　见图3。可以观察到用蛛丝结扎大鼠股动脉后的30min内，大鼠股动脉的收缩压与舒张压表现为缓慢的渐进性下降过程。 �
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　　蛛丝结扎30min内，大鼠股动脉的收缩压与舒张压�表现为缓慢的渐进性下降过程。�
　　图3 模型大鼠股动脉收缩压 舒张压变化曲线（�n�=10）�
　　2.4 血清OMP的变化
　　见图4。可以观察到用蛛丝结扎大鼠股动脉后，血清氧化修饰蛋白含量在手术后的前3天上升，3天后回落的情况。 �
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　　血清氧化修饰蛋白含量在手术后的前3天上升，3天后下降。�
　　图4 血清氧化修饰蛋白的生化检测结果（�n�=10）�
　　2.5 大鼠股动脉HE染色
　　见图5 。可以观察到用蛛丝结扎后，股动脉从部分闭塞发展为完全闭塞的渐进过程。 �
　　
　　A～E各图中，箭头1所指为股动脉管壁，箭头2所指为股动脉血管腔，箭头3所指为结扎蛛丝。以上各图显示了蛛丝结扎股动脉所产生的渐进过程与最终结果。A.结扎前的股动脉。图中见股动脉管壁清晰，未见白细胞浸润。B.结扎后1天的股动脉。由图可见在蛛丝和血管壁之间存在大量的白细胞。C.结扎后3天的股动脉。可见在股动脉结扎部位附近的血管腔内，白细胞和红细胞聚集并阻塞管腔。◆表示蛛丝结扎处形成的血栓，白细胞占有很大的比例。D.结扎后5天的股动脉。由图可见，结扎部位分布着大量的白细胞和红细胞，将血管管腔几乎完全阻塞。◆表示阻塞管腔的红细胞与白细胞夹杂的血栓，★表示残存的管腔（这并不表示股动脉存在畅通的血流）。E.结扎后10天的股动脉。由图可见，血管经过了一段较长时间的闭塞之后，血栓（◆表示的部分）出现再通现象，有一部分的血管管腔再次形成（★表示的部分），但这时活体状态下的股动脉仍不存在畅通的血流。�
　　图5 大鼠股动脉的HE染色 �
　　
　　3 讨 论
　　蛛丝有着非常卓越的弹性和自收缩性能。古代的中医外科医师使用蛛丝来结扎切除病人皮肤表面的赘生物，其可以有效并且毫无痛苦地产生7～10天持久的慢性切割作用，疗效确切。因此，本研究以10天作为观察周期，利用蛛丝特异的自收缩特性制作股动脉结扎致缺血动物模型。
　　目前的缺血性疾病动物模型大多只适用于急性缺血和急性缺血再灌注实验研究。这些缺血模型普遍存在局限性，原因在于大多数缺血模型动物都会非常快速的建立起有效的侧枝循环，从而在很短的时间内恢复血液的正常灌注[17]。所以有学者认为简单的结扎股动脉或者髂动脉并不能造成肢体局部充分的缺血[18]。正因为如此，动物的急性后肢缺血模型和临床上人类肢体的慢性局部缺血疾病之间的可比性并不是很好。相反地，亚急性或慢性的缺血过程可能更接近于临床。
　　本实验中明确地观察到了蛛丝对血管的亚急性机械结扎作用以及由此而引起的一系列生理与组织结构异常。笔者的观察证实：用蛛丝结扎血管、阻断局部血流是有效的，血压和血流量都呈现出亚急性的下降过程。在结扎即刻，血管即开始出现比较缓慢的、渐进而明确的狭窄变化过程，这一过程可以持续大约30min。之后，由于血流量已下降到较低水平，因此不再出现明显下降。在术后1～10天，HE染色显示出结扎血管逐渐呈现出完全闭塞的状态，并逐渐形成血栓以及血栓的再通，这些亚急性的组织缺血表现表明本实验在制作血管阻断性缺血模型上是可行性的。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　综上所述，笔者认为：蛛丝对血管，即使是象大鼠股动脉这类比较粗大的血管，也具有确切的结扎作用。其次，蛛丝的结扎过程是一个渐进的亚急性过程，而非立即的完全阻断。在本实验中蛛丝所表现出来的亚急性渐进阻断过程并没有象蛛丝对体表赘生物的结扎切割过程那样长和缓慢。其原因笔者认为可能跟以下因素有关：蛛丝的质量、结扎的手法以及局部组织特性等，例如干燥条件下结扎体表赘生物与湿性体内环境下结扎血管之间存在着很大的差别。因此在后续研究中，笔者还需进行进一步试验，采用包括生物工程合成蛛丝在内的其它种类蛛丝，探索更为合理科学的手术技术，并在机体的不同组织不同管径的血管局部进行进一步的深入研究。 下一步的研究方向：（1） 建立蛛丝结扎研究的标准流程：统一蛛丝采集、折叠和结扎过程中的生物力学等标准，使各项操作流程标准化，保证重复性，并将这些标准流程扩大到其它种类蛛丝的研究；（2） 扩大蛛丝结扎的使用范围：进一步研究蛛丝结扎对不同动物、不同组织、不同管径血管的影响；（3） 通过药物评价进一步验证蛛丝结扎造成的慢性缺血模型效果。 �
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　　注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”
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