培养基灭菌温度与时间的选择|培养基灭菌温度
时间：2019-02-03 04:36:55 来源：达达文档网 本文已影响 人 
摘要: 用湿热灭菌方法对培养基灭菌时,加热的温度和时间对微生物死亡和营养成分的破坏均有作用。由于培养基营养成分的破坏和菌体死亡都属于一级动力学反应,其反应速度常数与温度的关系皆可用阿累尼乌斯方程式表示;由此公式导出,当灭菌温度上升时,微生物杀死速率的提高要超过培养基成分的破坏速率的增加。所以采用高温快速灭菌方法,即可达到杀死培养基中的全部有生命的有机体,又可减少营养成分的破坏。
Abstract: When damp heat is used in medium sterilization, heating temperature and time are both the roles of on the microbial death and the destruction of nutrients. As the nutrient medium of destruction and the microbial death all pertains to A kinetics, the reaction rate constant with temperature could be expressed by Arrhenius equation; derived from the formula, when the sterilization temperature rises, the increasing microbial kill rate is greater than the increasing destruction rate of medium components. Therefore, high-temperature fast sterilization method, will not only meet the medium to kill all living organisms, but also reduce the destruction of nutrients
关键词: 菌体死亡速率常数;培养基成分的破坏速率常数;高温快速灭菌
Key words: bacterial death rate constant;rate constants of the destruction of culture medium composition;rapid high-temperature sterilization
中图分类号:Q93-3 文献标识码:A文章编号:1006-4311(2010)05-0205-02
0引言
绝大多数工业发酵是需氧的纯种发酵,因此,所使用的培养基、各种设备和附件以及通入罐内的空气均须彻底灭菌,这是防止发酵过程染菌、确保正常生产的关键。如果发酵中染了菌,不只是消耗了营养物质,更重要的是杂菌能分泌一些或抑制产生菌生长,或严重改变培养液性质,或抑制产物生物合成的有毒副作用的物质;或产生某种能破坏所需代谢物的酶类。轻者影响产量,重者导致“全军覆没”。所以工业发酵中杂菌污染是极大的威胁,我们就培养基的灭菌原理及方法重点介绍如下。
1灭菌方法的选择
灭菌是指利用物理或化学法杀或除去物料及设备中一切有生命物质的过程。灭菌方法大致可分为物理方法和化学方法两种。物理方法主要有蒸汽(高温)、电磁波和辐照等方式,蒸汽灭菌属于经典式的灭菌方法,而电磁波灭菌多采用2450nm和915nm微波灭菌和超声波灭菌。辐照灭菌可分为离子性辐照和非离子性辐照。非离子性辐照采用最广泛的是253.7nm波长的紫外线,由于光源发出的强度所限,虽不存在残留问题,但以上物理灭菌方法都有一定的局限性。化学方法多采用强氧化剂,如过氧化氢、过氧乙酸、环氧乙烷、卤素等,化学灭菌主要是依靠强氧化剂的氧化能力与细胞酶蛋白中的-SH-巯基结合转化为-SS-基,破坏蛋白质的分子结构,干扰细菌酶系统的代谢,使其失去活性。按照分子生物学的观点,就是对细胞的DNA 进行氧化性损伤,从而抑制细胞的增殖。使用化学灭菌会对容器和包材以及设备产生一定量的残留污染,必须采取严格的措施控制残留,以保障最终产品的安全性。
利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法。由于蒸汽具有很强的穿透能力,而且在冷凝时会放出大量的冷凝热,很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。从灭菌的效果来看,干热灭菌不如湿热灭菌有效,温度升高10℃时,灭菌速度常数仅增加2-3倍,而湿热灭菌对耐热芽孢的灭菌速度常数增加的倍数可达到8-10倍,对营养细胞则更高。
2湿热灭菌原理
在发酵工业中,对培养基和发酵设备的灭菌,广泛使用湿热灭菌法。工厂里,蒸汽比较容易获得,控制操作条件方便,是一种简单而又价廉、有效的灭菌方法。用湿热灭菌的方法处理培养基,其加热温度和受热时间与灭菌程度和营养成分的破坏都有关系。营养成分的破坏将影响菌种的培养和产物的生成,所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾,恰当掌握加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。
微生物受热死亡的原因,主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质,如酶等,发生凝固、变性,从而导致微生物无法生存而死亡。微生物受热而丧失活力,但其物理性质不变。在一定温度下,微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论[1]。在灭菌过程中,活菌数逐渐减少,其减少量随残留活菌数的减少而递减,即微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比,称之为对数残留定律,也即反映为一级化学反应动力学为:
■=-KN(2-1)
式中,N―残存的活菌数;t―灭菌时间(s);
K―灭菌速度常数(s-1),也称反应速度常数或比死亡速度常数,此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关;
dN/dt―活菌数瞬时变化速率,即死亡速率。
上式通过移项积分得:
■■=-K■dt
ln■=-Kt
ln■=Kt(2-2)
t=■・ln■=■・log■ (2-3)
式中:N■―开始灭菌(t=0)时原有活菌数;N■―经时间t后残存活菌数。
上式是计算灭菌的基本公式,灭菌速度常数K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。各种微生物在同样的温度下K值是不同的,K值愈小,则此微生物愈耐热。
即使对于同一微生物,也受微生物的生理状态、生长条件及灭菌方法等多种因素的影响,其营养细胞和芽孢的比死亡速率也有极大的差异,就微生物的热阻来说,细菌芽孢是比较耐热的,孢子的热阻要比生长期细胞大得多。例如,在121℃时,枯草杆菌FS5230的K为0.047-0.063s-1,梭状芽孢杆菌PA3679的K为0.03s-1,嗜热芽孢杆菌FS1518的K为0.013s-1,热芽孢杆菌FS617的K为0.048s-1。从上述的微生物对数死亡规律和对数残留方程式可知,如果要达到彻底灭菌,即灭菌结束时残留的活微生物数Nt=0,则灭菌所需的时间应为无限长,这在实际中是不可能的。因此,工程上,在进行灭菌的设计时,常采用Nt=0.001,即在1000次灭菌中,允许有一次失败。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 3灭菌温度和时间的选择
当培养基被加热灭菌时,常会出现这样的矛盾,在加热杀死微生物的同时,培养基中的有用成分也会随之遭到破坏。实验结果证明,在高压加热的情况下,培养基中的氨基酸和维生素极易被破坏,如在121℃,仅20min,就有59%的赖氨酸和精氨酸及其他碱性氨基酸被破坏,蛋氨酸和色氨酸也有相当数量被破坏。因此,选择一种既能满足灭菌要求又能减少营养成分破坏的温度和受热时间,是研究培养基灭菌质量的重要内容。
微生物的受热死亡属于单分子反应,其灭菌速率常数K与温度之间的关系可用阿累尼乌斯公式表示:
K =Aexp(-E/RT)(3-1)
或 lnK=lnA―E/RT(3-2)
式中:A―频率常数,也称阿累尼乌斯常数,s-1;R―气体常数,8.314J/(mol・K);T―绝对温度,K;E―微生物死亡活化能,J/mol。
由此可见,E/R是微生物受热死亡时对温度敏感性的度量,此值越大,表明微生物死亡速率随温度的变化越敏感;反之,就越不敏感,因此,在灭菌操作中,E/R是一个十分重要的参数。
绝大部分培养基的营养成分的破坏也属于一级分解反应[2],其反应动力学方程式为:
■=-K′C(3-3)
式中,C―反应物浓度,mol/L;t―反应时间,s;K―化学反应速度常数,1/s。
化学反应中,在其他条件不变的情况下,则反应速度常数与温度的关系可用阿累尼乌斯公式表示:
K′=A′exp(-E′/RT)(3-4)
或lnK′=lnA′―E′/RT(3-5)
式中,K′―培养基内易被破坏成分的分解速率常数;A′―频率常数,也称阿累尼乌斯常数,s-1;R―气体常数,8.314J/(mol・K);T―绝对温度,K;E′―培养基成分分解所需活化能,J/mol。
式(3-2)、(3-5)为一直线方程,以lnK(lnK′)对1/T作图,可得一直线。实际测得,一般杀死微生物营养体的E值为200-270kJ/mol,杀死微生物芽孢的E值为400 kJ/mol以上,一般酶类和维生素分解的E值为80 kJ/mol左右。
当灭菌温度从T1上升到T2时,灭菌的反应速度常数K值和营养成分分解的反应速度常速K′值的变化情况如下:
灭菌的K值变化,lnK1=lnA―E/RT1;lnK2=lnA―E/RT2(K1、K2分别为温度T1、T2时的反应速度常数)。两式相减得:
ln■=■■-■(3-6)
同样,当温度从T1升至T2时,营养成分分解的反应速度常数的变化也有上述关系:
ln■=■■-■(3-7)
式(3-6)除以式(3-7)得:
■=■(3-8)
由于杀死微生物的活化能E大于营养成分的活化能E■■[3],所以ln■>ln■,即随温度的升高,灭菌反应速度常数增加的倍数大于营养成分破坏反应速度常数增加的倍数。也就是说,当灭菌温度上升时,微生物杀死速率的提高要超过培养基成分的破坏速率的增加。所以采用高温快速灭菌方法,即可达到杀死培养基中的全部有生命的有机体,又可减少营养成分的破坏。 如将芽孢杆菌和维生素B2放在一起灭菌的试验发现,当温度升至118℃,加热时间为15min,可杀死99.99%的细菌芽孢,维生素B2破坏率为10%;而在温度128℃下加热1.5min,细菌芽孢的死亡率仍为99.99%,而维生素的破坏率为5%。由此可见,在高温下灭菌,时间是一个非常重要的因素,表1表示杀死细菌芽孢与保留B族维生素的时间与温度关系以及在不降低规定的灭菌前提下(Nt=0.001),灭菌温度、时间和营养成分破坏量的关系。
4总结
采用湿热高温快速灭菌法,不但可达到完全灭菌的要求,而且灭菌时间短,物料中营养物质破坏少,物料质量几乎不变,营养成分保存率达92%以上,生产效率很高,所以现在被发酵工业广泛采用。
参考文献:
[1]熊宗贵.发酵工艺原理[M].北京:中国医药科技出版社,2001.
[2]高平,刘书志.生物工程设备[M].北京:化学工业出版社,2006.1.
[3]于文国.微生物制药及反应器[M].北京:化学工业出版社,2005.6.
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