重组人促红细胞生成素对感染致急性肝脏损伤大鼠的保护作用

桑珍珍 许云 盛英杰 贾冬 金帅 张鹏思 赵敏

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.12.007

基金项目：国家自然科学基金（81171793）;国家临床重点专科建设项目资助

作者单位：110004沈阳，中国医科大学附属盛京医院急诊科

通信作者：
赵敏，Email：zhaom@sj-hospital.org.

【摘要】目的探讨重组人促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin，rHuEPO）对盲肠结扎穿孔术（CLP）所致大鼠急性肝损伤的保护作用。方法96只雄性SD大鼠随机（随机数字法）分为：假CLP组（对照组），CLP组（脓毒症组），rHuEPO组。采用盲肠结扎穿孔术复制急性肝损伤的动物模型，rHuEPO组造模后即刻经尾静脉推注rHuEPO 5000 U/kg。手术后连续观察24 h，选择术后2 h、6 h、12 h、24 h为观察点。分别在各时点随机处死大鼠，采用酶联免疫法（ELISA法）检测血清TNF-α、iNOS水平变化;同时检测肝功能（ALT、AST）;采用光镜和透射电镜观察肝组织形态学变化。结果①各时间点大鼠血清中ALT、AST、TNF-α、iNOS水平的变化为脓毒症组及rHuEPO组上述指标明显高于对照组;rHuEPO组与脓毒症组相比，上述指标明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。②光镜及电镜观察发现，脓毒症时肝脏病理学改变为局灶性肝细胞坏死，炎性细胞浸润，小叶间静脉充血扩张，肝细胞核固缩，线粒体、内质网明显减少。rHuEPO组肝脏病理学改变较CLP组明显减轻。结论rHuEPO能够降低血清中ALT、AST、TNF-α、iNOS水平，发挥调节炎症反应进而改善肝功能的作用，对感染所致急性肝损伤具有一定的保护作用。

【关键词】重组人促红细胞生成素;盲肠结扎穿孔术;脓毒症;急性肝损伤

Protective effects of recombinant human erythropoietin against acute liver injury induced by sepsis in rats

Sang Zhenzhen， Xu Yun， Sheng Yingjie， Jia Dong， Jin Shuai， Zhang Pengsi， Zhao Min. Department of Emergency Medicine Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，China

Corresponding author：Zhao Min， zhaom@sj-hospital.org

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effects of recombinant human erythropoietin （rHuEPO） on caecal ligation and puncture （CLP）-induced acute liver injury. Methods Ninety-six healthy male Sprague-Dawley rats weighing 250-300 g were randomly divided into 3 groups：
normal control group （sham group， n=32）， CLP model group （sepsis group， n=32） and rHuEPO treatment group （n=32）. The rat model of sepsis was established by caecal ligation and puncture. In treatment group， rats were treated with rHuEPO 5000 U/kg administered through caudalis vein after CLP procedure. Continuous observation was carried out until 24 h after modeling. Of each group， 8 rats were sacrificed at 2 h， 6 h， 12 h and 24 h， respectively， and then the liver tissue samples and blood samples were collected. Blood samples were assayed for determining the levels of serum cytokines [tumor necrosis factor-alpha （TNF-α）]， and inducible nitric oxide synthase （iNOS） by using the enzyme-linked immunoadsorbentassay （ELISA） method. The levels of serum alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） were also detected. Histopathological changes of liver tissues were observed under optical and transmission electron microscopy.Results ①The levels of ALT， AST， TNF-a， iNOS in serum of rats in control group were lower than those in model group and rHuEPO group （P<0.01）. The levels of TNF-α， IL-6 and iNOS in serum of rats in rHuEPO group were decreased significantly compared with model group （P<0.01）. ② The optical microscopy and the transmission electron microscopy showed hepatocyte edema， liver focal necrosis， inflammatory cell infiltration in portal area and severe congestion of interlobular veins， hepatocyte karyopyknosis， mitochondrial and endoplasmic reticulum （ER） obviously decreased in sepsis group at 24 h. Hepatic injury was attenuated after employment of rHuEPO.ConclusionsRecombinant human erythropoietin can inhibit the levels of ALT， AST， TNF-a， iNOS in serum ，thus modifying the inflammatory response and providing protective effects against acute liver injury in the wake of infection.

【Key words】Recombinant human erythropoietin;Caecal ligation and puncture; Sepsis;Acute liver injury

全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）是因感染或非感染病因作用于机体而引起的机体失控的自我持续放大和自我破坏的全身性炎症反应。脓毒症（sepsis） 是由感染引起的全身炎症反应综合症（SIRS） ，其本质是机体过度释放炎症介质导致炎症反应失控和免疫功能紊乱，它是多器官功能障碍（multiple organ dysfunction syndrome，MODS） 的前兆，其导致的脓毒性休克是主要的死亡原因^[1]。临床上胃肠道往往亦是外科打击的“中心”器官，危重患者一旦出现“肝功能损害—能量代谢障碍—自身抵抗力下降—脓毒症加重—肝功能障碍进一步加剧”的级联反应，预后较差，因此肝功能的保护是能否成功救治危重病患者的关键^[2]。近年研究发现，临床上用于改善尿毒症患者贫血状态的重组人促红细胞生成素（rHuEPO）具有抗氧化、抑制细胞凋亡、抑制炎症反应、诱导缺血耐受及促进肾小管上皮细胞再生等作用，是一种维持机体内环境稳定的多功能细胞因子，对多种器官和组织具有多种保护作用^[3]。本实验通过盲肠结扎穿孔术建立脓毒症大鼠急性肝损伤模型，观察rHuEPO对脓毒症所致急性肝损伤的保护作用及其机制，为临床应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物、分组、模型制备

7周龄Sprague-Dawly（SD）健康雄性大鼠，体质量250～300 g（由中国医科大学附属盛京医院动物部提供），清洁级，96只。实验大鼠随机（随机数字法）分成3组：（1）假CLP组（n=32，对照组）：只翻动盲肠，不结扎穿孔;（2）CLP组（n=32，脓毒症组）：行盲肠结扎穿孔术;（3）rHuEPO组（n=32）：行盲肠结扎穿孔术后即刻经尾静脉静注rHuEPO 5000 IU/kg 。术后均补充生理盐水3 mL/100 g抗休克。

CLP模型的标准步骤主要参考Rittirsch等^[4]的报道，实验前12 h禁食过夜，自由饮水。CLP组和rHuEPO组采用经典的盲肠结扎穿孔法（CLP）复制脓毒症急性肝损伤模型，即用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉，无菌条件下沿腹中线切开腹壁，切口长约2 cm，逐层分离、结扎盲肠，在盲端肠壁用9号针穿刺2次，留置1条长1 cm宽2 ㎜、两头贯穿盲肠的橡皮片，挤出少许粪便，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁，清醒后转入代谢笼内自由进食水。假手术组大鼠麻醉后，除不进行盲肠结扎穿刺外，其余操作同CLP手术组。术毕补充生理盐水3 mL/100 g，术后自由饮食水。

1.2实验药品和试剂

重组人促红细胞生成素（rHuEPO） 购自沈阳三生制药有限公司。肿瘤坏死因子酶联免疫分析（TNF-α ELISA）试剂盒和诱导型一氧化氮合成酶酶联免疫分析（iNOS ELISA）试剂盒均购自美国RD公司。10%水合氯醛（东北制药总厂）;灭菌生理盐水100 mL（大冢制药公司）;10%甲醛溶液（东北制药总厂）。

1.3主要仪器

鼠操作台、无菌手术器械、环氧乙烷灭菌子弹头、上海80-2离心沉淀器、DS-671电子秤、Saotorius电子天平、4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、-80 ℃冰箱、LS-100型病理石蜡包埋机、切片机、烘箱、ZT-12M生物组织自动脱水机、  NIKonEelipseE800显微镜、日本日立H-750透射电子显微镜、日本SONY数码照相机、LDZX-4OBI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器、美国 VITROS950全自动干生化分析仪。

1.4标本留取及处理

1.4.1血标本的留取与处理从术后腹壁缝合结束开始计时，分别于2 h、6 h、12 h、24 h取材。下腔静脉抽血5 mL， 离心（3000 r/min）15 min，取上清，无菌条件下装入无菌EP管后，置-80 ℃低温冰箱中保存。标本收集完整后，采用酶联免疫法统一测定细胞因子TNF-α、iNOS。采用生化分析仪测定血清ALT、AST。

1.4.2组织标本的留取与处理大鼠放血处死后迅速剪开腹腔，立即从腹腔取出肝脏。取肝组织一块置于10%甲醛溶液中以备光镜检查。取肝组织，将其切成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，置于2.5%戊二醛溶液中24～48 h待电镜检查。

1.5检测指标及方法

1.5.1肝功能分析采用全自动干生化分析仪测定大鼠血清ALT、AST指标。

1.5.2大鼠血清肿瘤坏死因子（TNF-α）、诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）均采用ELISA法测定，严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.6统计学方法

实验数据计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 17.0版软件包（SPSS Company，Chicago，Illinois，USA）进行分析，单因素两组以上的均数间差异比较用单因素方差分析（One Way ANOVA），以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1一般情况的观察

脓毒症时大鼠病态明显，蜷缩，活动减少，不饮水，不再合群取暖，竖毛，呼吸急促，分泌物由鼻腔溢出，眼角出现渗出物等。剖腹可见浑浊脓血性渗液、恶臭、肠管水肿、空肠肠管胀气，肠粘连，并可见散布于盲肠、大网膜、肠系膜等处出血、坏死灶和皂化斑;肝脏大小无明显改变，颜色呈暗红色，表面可见散在的点状瘀血等。对照组大鼠麻醉清醒后活动基本如常。rHuEPO处理后，大鼠上述病态表现较轻：仍饮水、眼角未出现渗出物、剖腹可见清亮渗液，无肠管胀气和肠粘连，肝脏色泽稍暗，未见出血点。

2. 2各组大鼠肝功能的变化

从表1-2中可以看到，CLP术后6 h，大鼠血清中ALT、AST的含量开始升高，24 h达最高，各时间点之间差异具有统计学意义（P<0.05）。脓毒症时，大鼠血清中ALT、AST的含量显著高于同时间点假CLP组，差异有显著统计学意义（P<0.01），用rHuEPO治疗后，大鼠血清中ALT、AST的含量明显回降，但是仍然高于正常对照组（P<0.01），差异有显著统计学意义（P<0.01）。见表 1-2。

2. 3 各组大鼠血清TNF-α、iNOS含量的变化

表3、表4看出，CLP术后6 h大鼠血清中TNF-α、iNOS的含量开始升高，24 h达到高峰，各时间点之间差异具有统计学意义（P<0.05）。脓毒症时，大鼠血清中上述指标的含量显著高于同时间点假CLP组，差异有显著统计学意义（P<0.05）;用rHuEPO治疗后，大鼠血清中上述指标的水平明显回降，但是仍然高于同时间点假CLP组（P<0.05）。

2.4CLP术后24 h肝组织形态学改变

光镜：对照组肝细胞形态正常。脓毒症时可见局灶性肝细胞坏死。坏死灶中大量中性粒细胞浸润，坏死灶周围肝细胞呈水肿样改变，肝索排列紊乱，门管区亦可见大量炎症细胞浸润，小叶间静脉充血扩张。rHuEPO处理后，肝细胞坏死面积明显减少，肝细胞水肿减轻，门管区炎性细胞浸润较少，小叶间静脉充血减轻。见图1。电镜：对照组肝细胞核、线粒体、内质网基本正常。脓毒症时可见肝细胞核固缩、染色质呈块状、核膜不清，线粒体、内质网明显减少，内质网扩张、脱颗粒。rHuEPO处理后，内质网和线粒体仅见个别扩张，个别核膜不完整、染色质边集。见图2。

A：对照组大鼠肝组织肝细胞形态正常，门管区无炎症细胞浸润，小叶间静脉无充血;B：脓毒症组大鼠肝组织局灶性肝细胞水肿坏死，肝索排列紊乱，坏死灶及门管区大量炎症细胞浸润，小叶间静脉充血扩张;C：rHuEPO组大鼠肝组织肝细胞水肿减轻，点状坏死区炎性细胞浸润减少，小叶间静脉充血减轻

图13组大鼠肝组织（HE×200）

Fig1Liver tissue in three group （HE×200）

A：对照组大鼠肝脏细胞器肝细胞核、线粒体、内质网基本正常;B：脓毒症组大鼠肝脏细胞器肝细胞核固缩、染色质呈块状、线粒体明显肿胀、内质网明显减少;C：rHuEPO组大鼠肝脏细胞器细胞核内部分染色质边集、内质网未见显著减少、线粒体肿胀程度较轻

图23组大鼠肝脏细胞器（Em×12 000）

Fig2Organelles of liver in three groups（Em×12 000）

3讨论

盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture， CLP）导致的脓毒症是一个经典模型，被广泛用于模拟临床脓毒症。盲肠穿孔导致驻扎在肠道的微生物渗出，造成腹部局部感染、细菌性腹膜炎，随后引起全身性炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），MODS甚至死亡^[5]。脓毒症时，肝脏损伤发生较早，最终可发展为肝衰竭。因此CLP模型是筛选和研究治疗或预防感染致肝损伤药物的理想模型。

肿瘤坏死因子-a （tumor necrosis factor-α，TNF-α）是细胞因子中最早出现的最主要的一种^[6]，它能启动后续的一系列病理生理改变，与炎症反应的程度相关。诱导型一氧化氮合酶（inducible NO synthase，iNOS） 是核转录因子（nuclear factor-kappaB，NF-κB）的下游效应分子，参与炎症反应^[7]。iNOS被激活时产生的大量NO及其代谢产物超氧亚硝酸盐具有细胞毒性作用^[8]。NO可通过线粒体途径参与脓毒性炎症反应所介导的肝脏损伤^[9]。在脓毒症导致ARDS的研究中发现，细胞因子TNF-α、IL-1为近端细胞因子，通过刺激肺细胞产生远端细胞因子，始动细胞因子瀑布。它们相互诱导，主要通过单核细胞和巨噬细胞产生趋化物质，使外周血的炎性细胞在肺内聚集。远端细胞因子包括IL-6、IL-8，它们积极参与肺炎症和修复^[10]。因而TNF-αa、iNOS都是目前基础实验中经常选用的评价机体炎症反应程度和治疗效果的指标。本实验研究发现，CLP术后大鼠的肝脏进行性充血肿大，血清ALT、AST进行性升高以及肝细胞形态学进行性恶化提示发生了肝脏损伤，可确认大鼠CLP术后脓毒症模型造成了急性肝损伤。脓毒症时炎症感染致急性肝损伤的机制可能为：各种损伤通过触发宿主体内的内源性介质，在多种炎性细胞的参与下，使细胞因子网络各成员间相互的调控失败，造成细胞因子间的恶性刺激，激发体液级联反应，导致全身的脓毒性反应和远隔器官系统功能的损害——肝损伤。感染时所释放的毒素（特别是G-菌内毒素）以及活化的炎症细胞释放的炎症因子作用于炎症细胞，激活Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4），经过一系列级联信号传递，激活NF-κB细胞内信号转导通路，继而启动TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等促炎细胞因子和粘附分子等基因的转录。由炎症细胞活化而分泌的炎症介质又进一步促进炎症细胞的激活，二者互为因果，形成炎症瀑布（inflammatory cascade），引起肝损伤。NF-κB的下游效应分子iNOS，在炎症感染时过度表达，导致NO的过度合成与释放，NO及其代谢产物超氧亚硝酸盐介导肝脏损伤。

有研究发现脓毒症时释放的炎症介质阻止促红细胞生成素（erythropoitin，EPO）生成，在肾内IL-6阻止EPO生成，在体外IL-1、TNF-α、TGF-β阻止EPO生成。EPO是一种刺激骨髓造血的糖蛋白类激素，主要由肾脏皮质、髓质交界处的肾小管旁细胞分泌，相对分子质量为30.4×103[11]。重组人红细胞生成素（recombinant human erythropoietin ，rHuEPO）的基因序列和EPO的基因序列大体相同，只是多增加个糖基。近年来发现，EPO是一种多功能细胞保护因子，具有抗凋亡、抑制炎性反应、抗氧化应激等作用^[12]。有研究表明，EPO在炎症反应过程中具有类似类固醇样的抗炎作用，可抑制炎性细胞的浸润和前炎性因子的表达^[13]。Hojman等^[14]证明EPO预处理可明显抑制心肌缺血-再灌注损伤后的NF-кB的活性，并降低循环TNF-α和IL-6的水平。Pappo等^[15]研究发现EPO可以抑制肝脏缺血-再灌注损伤后的NF-кB的表达，进而减轻肝脏损伤。Tsao等^[16]证明EPO可以降低脓毒症大鼠血清中IL-6的水平和肺组织iNOS的表达。有国内外学者研究发现，EPO可以抑制急性肾损伤大鼠肾脏iNOS及NF-кB的表达，调节炎症反应，从而减轻大鼠肾脏损伤，发挥保护肾脏的作用^[17-18]。Moran等^[19]证明EPO可以减轻肝脏的氧化应激损伤，通过减少NO的生成及增加还原性谷胱甘肽（GSH）的生成。余堂宏等^[20]研究发现，EPO能通过抗氧自由基损伤，提高内源性抗氧化能力达到对急性肾小管坏死大鼠肾脏起到保护作用。本研究结果发现，在CLP致急性肝损伤模型后给予rHuEPO，与脓毒症时相比，肝脏组织病理学结果显示，光镜下肝细胞坏死面积明显减少，肝细胞水肿减轻，门管区炎性细胞浸润较少，小叶间静脉充血减轻;电镜下内质网和线粒体仅见个别扩张，个别核膜不完整、染色质边集，损伤程度较脓毒症组明显减轻;各个时间点大鼠血清iNOS、TNF-α、ALT、AST的水平显著下降。上述指标的变化，与国内外报道结果类似，进一步证实rHuEPO对脓毒症大鼠的肝脏具有保护作用。rHuEPO作为一种多功能细胞因子，减轻CLP所致急性肝损伤的机制可能是通过调节NF-κB的表达，抑制 iNOS的过度表达，并降低TNF-α等炎症因子水平，从而减轻肝脏损伤。rHuEPO对于提高炎症感染导致急性肝损伤的治疗效果具有重要意义，同时将为攻克脓毒症防治难题开启新的途径，为下一步分子机制的研究打下基础。

参考文献

[1]梁小仲，姚华国，邵义明，等.姜黄素对脓毒症大鼠肺组织高迁移率族蛋白B1水平的影响[J]. 中华临床医师杂志， 2011，5（ 3） ：854.

[2]陈德昌，李红江，乔林，等.大黄对创伤后脓毒症大鼠肝细胞线粒体功能的影响[J]. 中国中西医结合急救杂志，2002，9（1）：9-11.

[3]Kakavas S，Demestiha T，Vasileiou P，et al. Erythropoetin as a novel agent with pleiotropic effects against acute lung injury[J].  Eur J Clin Pharmacol，2011，67（1）：1-9.

[4]Cerda J，Sheinfeld G，Ronco C.Fluid overload in critically ill patients with acute kidney injury[J].  Blood Purif，2010，29（4）：331-338.

[5]Yang J，Dai Y， Xia YF，et al . Alpinia katsumadai Hayata prevents mouse sepsis induced by cecal ligation and puncture through promoting bacterial clearance and downregulating systemic inflammation[J].  PhytotherRes， 2009，23（2）：267.

[6]Janssen，Van Doom K，Spapen H，et al.Sepsis-related acute kidney injury：
A protective effect of drotrecogin alpha（activated）treatment[J].  Acta Anaesthesiol Scand，2008，52（9）：1259-1264.

[7]Zhang Q，Piao XL，Piao XS，et al.Preventive effect of Coptis chinensis and berberine on intestinal injury in rats challenged with lipopolysaccharides[J].  Food Chem Toxicol，2011 ，49（1）：61-69.

[8]Cauwels A，Brouckaert P.Nitrite regulation of shock[J].  Cardiovasc Res，2011，89（3）：553-559.

[9]Tu W，Satoi S，Zhang Z，et al .Hepatocellular dysfunction induced by nitric oxide production in hepatocytes isolated from ratswith sepsis[J].  Shock，2003，19（4）：373-377.

[10]朱晓丹，白春学.ALI/ARDS发病机制及治疗研究进展[J]. 中华急诊医学杂志，2010，19（10）：1111-1113.

[11] Brines M，Cerami A.Erythropoietin-mediated tissue protection：reducing collateral damage from the primary injury response[J].  Int ern Med ，2008，264（5）：415 -432.

[12] Brines M，Patel NS，Villa P，el a1.Nonerythropoietic tissueprotective peptides derived from the tertiary structure of erythr0poietin[J].  Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（31）：10925- 10930.

[13] Kumral A，Baskin H，Yesilirmak DC，et al.Erythropoietin attenuates lipopolysaeeharide-induced white matter injury in the neonatal rat  brain[J].  Neonatology，2007，92（4）：269-278.

[14] Hojman P，Taudof S，Lundby C， et al.Erythropoietin augments the cytokine response to acute endotoxin-induced inflammation in humans [J].  Cytokine，2009，45（3）：154-157.

[15] Pappo O，Ben-Ari Z，Shevtsov E，et al.The role of excessive versus acute administration of erythropoietin in attenuating hepatic ischemia-reperfusion injury[J]. Can J Physiol Pharmacol，2010，88（12）：1130-1137.

[16] Tsao CM， Chen SJ，Shih MC，et al. Effects of terbutaline on circulatory failure and organ dysfunction induced by peritonitis in rats[J].  Intensive Care Med，2010 ，36（9）：1571-1578.

[17] Mohamed HE，EI-Swefy SE，Mohamed RH，et al.Effect of erythropoietin therapy on the progression of cisplatin induced renal injury in rats[J].  Exp Toxicol Pathol，2013 ，65（1-2）：197-203.

[18] Yang FL，Subeq YM，Chiu YH，et al.Recombinant human erythropoietin reduces rhabdomyolysis-induced acute renal failure in rats[J].  Injury，2012，43（3）：367-373.

[19] Moran M，Oruc MT，Ozmen，et al.Effect of erythropoietin on oxidative stress and liver injury in experimental obstructive jaundice[J].  Eur Surg Res， 2009，43（2）：228-234.

[20]余堂宏，胡宏，梁伟，等.促红细胞生成素防治大鼠急性肾小管坏死的实验研究[J]. 中华急诊医学杂志，2010，19（11）：1185-1187.

（收稿日期：2014-06-12）

（本文编辑：何小军）

p1327-1332