痰瘀共治对大鼠动脉粥样硬化斑块的影响及其可能机制:动脉粥样硬化斑块怎样消除
时间：2019-01-26 04:52:38 来源：达达文档网 本文已影响 人 
摘要：目的：探讨痰瘀共治方对大鼠动脉粥样硬化(ather06clerosis，AS)斑块的影响及其可能机制。方法：12周龄雄性Wistar大鼠85只。随机分为5组：①正常组(the control group，C，n=20)，②模型组(the model group，M，n=20)，③罗格列酮组(the Rosiglitazone group，RSG，n=15)，④痰瘀共治低剂量组(TYD，n=15)。⑤痰瘀共治高剂量组(TYG，n=15)。采用高脂饲料喂饲法加雏生素D3负荷法复制大鼠AS模型，6周后取C组及M组大鼠各5只，以主动脉HE染色切片发现AS斑块作为造模成功指标。造模成功后除正常组喂饲基础饲料，余组继续喂饲高脂饲料，并分别加予生理盐水[10mL/(kg・d)]、罗格列酮(3mg/kg)、痰瘀共治方流浸膏高剂量(0.8g/mL)、痰瘀共治方流浸膏低剂量(1.6g/mL)灌胃治疗6周后处死，HE染色观察大鼠主动脉形态学变化，免疫组织化学染色法观察主动脉过氧化物酶体增值物激活受体γ(PPARγ)蛋白表达的变化，并检测空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)，计算胰岛素抵抗指数(HOMA－IR)。结果：高脂饮食加维生素D3负荷6周后造模成功。光镜下观察可见主动脉典型的粥样硬化斑块；灌胃治疗6周后，与M组比。各治疗组大鼠FPG、FISN、HOMA－IR水平均降低(p＜0.05或P＜0.01)，HE染色见斑块明显消退，PPARγ蛋白表达平均光密度值明显减弱。以TYG组(1.08±0.03)作用显著(p=0.0025)，低于TYD组(2.84±0.07)(p=0.034)，与RSG组(1.12±0.05)比差异亦没有统计学意义(P=0.427)，同时各治疗组与c组比差异没有统计学意义(p＞0.05)。结论：痰瘀共治方可能通过激活PPARγ，改善胰岛素抵抗起到抗动脉粥样硬化的作用。
关键词：痰瘀共治；动脉粥样硬化；大鼠；过氧化物酶体增殖物激活受体γ
中图分类号：R－33 文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2008)07－1466－04
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管病发生的最主要原因，最近研究显示，核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxlsome prollferator activated receptor－γ，PPARγ)参与了血管壁炎症反应和AS发生发展的调控，但对其在AS形成中的具体机制尚存较多争议。胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是AS的重要危险因素，是产生“痰浊”和由“痰”致“瘀”，终致“痰瘀痹阻”的共同土壤，本研究采用痰瘀共治方法治疗AS模型大鼠，观察其对大鼠AS斑块的作用及可能机制。
1 材料
1．1 动物 12周龄雄性Wistar大鼠85只，体重(250±10)g，购自复旦大学实验动物科学部，按纯系动物要求专人饲养于浙江中医药大学动物实验中心清洁级动物房。
1．2 主要试剂及仪器 胆固醇(分析纯)(上海伯奥生物科技有限公司)、胆酸钠(上海源聚生物科技有限公司)、丙基硫氧嘧啶为(南通制药总厂)、维生素D3注射液(上海通用药业股份有限公司)、PPARγ－抗(sc－7273)(Santa Cruz公司)、Envision二抗(Darko公司)、DBA显色剂(北京中杉公司)、胰岛素放射免疫分析试剂盒(北京北方生物技术研究所)、SSOOPP半自动生化分析仪(法国Secomam公司)、高速台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司)。
2 方法
2．1 造模方法 对照组喂食基础饲料(其中面粉20％，米粉2％，玉米20％，麸皮25％，豆料20％，骨粉2％，鱼粉2％)，实验组喂食高脂饲料，即3％胆固醇、0.5％胆酸钠、0.2％丙基硫氧嘧啶、5％白糖、10％猪油、81.3％基础饲料，同时在喂食开始时一次性腹腔注射维生素D340万IU/kg，对照组给予同等体积的生理盐水。
2．2 分组及给药方法 参照随机数字表将12周龄雄性Wistar大鼠85只，随机分为5组：①正常对照组(the Control group，C，n=20)：喂食基础饲料6周后处死5只检测，余15只继续喂食基础饲料6周；②模型组(the Modelgroup，M，n=20)：喂食高脂饲料6周后处死5只检测，余15只继续喂食高脂饲料，并加予生理盐水[10mL/(kg・d)]灌胃6周；③罗格列酮组(the Rosiglitasone group，RSG，n=15)；④痰瘀共治低剂量组(TYD，n=15)；⑤痰瘀共治高剂量组(TYG，n=15)，喂食高脂饲料6周后，分别加予罗格列酮片(葛兰素史克公司提供，批准文号：H20020475)(3mg/kg)、痰瘀共治方流浸膏低剂量(0.8g/mL)、痰瘀共治方流浸膏高剂量(1.6g/mL)(按实验动物与人用药剂量换算公式计算)灌胃6周。
2．3 大鼠空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)空腹胰岛素(fasting insulin，HNS)检测大鼠禁食12h，3％戊巴比妥钠0.15mL/kg体重腹腔注射麻醉，腹主动脉取血4mL，用半自动生化分析仪(法国Secomam公司)测定空腹血糖(FPG)，放免法测空腹胰岛素(FINS)，采用稳态模式评估法评价胰岛素抵抗指数HOMA－IR=FPG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5。
2．4 病理形态观察 动物处死后，迅速分离主动脉周围结缔组织，沿主动脉瓣至髂动脉分支处剥离全长动脉，纵向剪开，10％甲醛溶液中固定，取主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉中段纵切面，石蜡包埋，连续切片作H－E染色，光镜下观察主动脉粥样硬化斑块的病理形态改变。
2．5 组织PPARγ蛋白表达检测 利用石蜡切片做免疫组化染色，采用Envision二步法。水浴恒温捞片贴于多聚赖氨酸处理过的玻片，烘干，二甲苯脱蜡，无水酒精洗二甲苯，高温修复1.5min，0.1mo/L PBS(pH7.4)洗5min，更换3次。加一抗，37℃孵育60min，PBS洗3次，滴加Envision二抗，37℃孵育20min，PBS洗3次，DAB显色3－10min，水洗，苏木素淡染，蓝化，脱水，透明，封固。结果用图像分析系统每个切片随机选5个高倍视野，分别测量其光密度，再计算平均光密度。PPARγ的表达强弱用平均光密度值的大小表示。
2．6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件包分析，本实验所得数据均为计量资料，经检验为正态分布资料，结果以均数±标准差(x±s)表示，成组设计的两样本比较选用两 独立样本t检验；各治疗组与正常对照组比较选用Dunnet t检验；治疗组间两两比较选用Newman－Keuls test检验。检验标准以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著性统计学意义。
3 结果
3．1 造模成功后正常对照组与模型组大鼠主动脉的病理形态改变造模6周后光镜下观察可见，模型组大鼠主动脉(图1)可见内皮细胞排列不完整，内膜增厚，内皮下间隙增宽，含有单核细胞源性泡沫细胞，同时可见数量不等的合成型平滑肌细胞及淡红色染色的一些弹力纤维、胶原纤维、蛋白聚糖等间质，并在此病变的基础上出现了钙化灶，形成了典型的AS斑块，对照组大鼠(图2)未见明显病理形态学改变。
3．2 灌胃治疗后各组大鼠空腹血糖空腹胰岛素水平的变化由表1可见，灌胃治疗6周后，与C组相比，M组大鼠FPG、FINS、HOMA－IR水平均升高(P＜0.05或P＜0.01)；与M组大鼠比，各治疗组大鼠FPG、FISN、HOMA－IR水平均降低(P＜0.05或P＜0.01)，以TYG组变化最明显，低于TYD组p＜0.05，与RSG组比差异亦没有统计学意义P＞0.05；并且各治疗组与G组比差异没有统计学意义。由此说明动脉粥样硬化大鼠存在胰岛素抵抗，痰瘀共治方具有与罗格列酮相似的改善胰岛素抵抗的作用。
3．3 灌胃6周后各组大鼠主动脉的病理形态改变及PPARγ蛋白表达的变化HE染色显示，M组大鼠主动脉仍可见典型的AS斑块病变，并有较多钙化；余各治疗组大鼠AS斑块病变的程度较M组明显减轻、消退，以TYG组明显。见图3。
灌胃治疗6周后，与C组比，M组(图4)大鼠主动脉粥样硬化斑块中PPAγ阳性组织及阳性细胞的平均光密度值明显升高(6.37±1.04 v8 0.69±0.08，P=0.0017)；与M组比，各治疗组大鼠PPAaγ蛋白表达平均光密度值均明显减弱，以TYG组(图5)(1.08±0.03)作用显著(P=0.0025)，低于TYD组(2.84±0.07)(P=0.034)；与RSG组(1.12±0.05)(图6)比差异亦没有统计学意义(P=0.427)，各治疗组与C组比差异没有统计学意义(P＞0.05)。由此可见，痰瘀共治方具有激PPARγ改善胰岛素抵抗消退在AS斑块的作用。
4 讨论
AS属中医“痰浊”、“血瘀”的范畴。饮食不节、脾失健运而致痰浊，痰浊内聚，注入血脉，滞塞脉络，日久营血瘀滞。痰瘀互结，沉积血府，脉道失柔，这种痰浊瘀血相凝之结块即是AS斑块。
本研究采用喂食高脂饲料与一次性腹腔注射维生素D340万IU/kg相结合的方法，6周后成功建立了As大鼠的模型，并在光镜下观察到了主动脉HE染色切片典型的As斑块病变。实验证明高脂饮食可促进AS斑块的形成，另有研究表明维生素D，能显著促进AS的发生，经腹腔注射维生素D3后血钙浓度出现显著升高，并能显著破坏动脉管壁内皮的完整性，继发血管平滑肌细胞局灶性增殖等和钙盐沉积于动脉壁。 从整体水平看，AS始终存在脂质代谢紊乱，而胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱是“痰浊”的物质基础，血液流变学异常则是“痰瘀痹阻”的客观指征，故胰岛素抵抗是产生“痰浊”和由“痰”致“瘀”，终致“痰瘀痹阻”的共同土壤，是机体生化物质渐进为“痰瘀”的量变过程。治疗上只有采取化痰散结、活血化瘀的方法，才可使已胶结之痰浊瘀血、日久坚凝之斑块软化消散，因此应痰瘀共治。罗格列酮是过氧化体增殖物激活型受体γ(PPAnγ)的人工合成配体激动剂，可通过改善胰岛素抵抗、降低血糖、纠正脂代谢紊乱、抗炎等机制间接发挥抗AS的作用。PPARγ是核受体超家族PPARs成员，是配体依赖的核转录因子，最近研究显示，PPARγ参与了血管壁炎症反应和AS发生发展的调控，但对其在AS发病机制中的作用尚存争议，并日益成为研究热点。
因此笔者以罗格列酮做为阳性对照，应用痰瘀共治流浸膏灌胃治疗干预大鼠AS过程，同时观察胰岛素抵抗的改善情况及PPARγ蛋白表达的变化。痰瘀共治方是在经典古方瓜萎薤白半夏汤和血府逐瘀汤基础上，结合我们的长期临床实践经验加减而成，方剂组成为全瓜萎、薤白、丹参、水蛭等，具有除湿祛痰、活血化瘀的功效，用于胸痹辨证为痰瘀互结证的病人的治疗，取得了满意的疗效。
研究表明，AS大鼠存在胰岛素抵抗。笔者的研究发现，模型组大鼠胰岛素抵抗指数较正常对照组明显升高(12.42±4.13 vs 7.79±2.58，P＜0.01)且主动脉AS斑块中PPAR"y蛋白表达也明显升高(6.37±1.04 vs 0.69±0.08，P＜0.01)，这与Marx叫等的研究相符，斑块处肌源性及巨噬细胞源性泡沫细胞增多，因此在单核细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞表达的PPARγ亦增多，故见AS病变局部PPARγ蛋白表达增高。痰瘀共治方与罗格列酮灌胃治疗后大鼠FPG、FISN、HOMA－IR水平和PPARγ蛋白表达平均光密度值均明显降低(P＜0.05或p＜0.01)，以痰瘀共治高剂量组变化明显，且与罗格列酮组比差异没有统计学意义。
周晓霞等研究发现，三七总皂苷可呈浓度依赖性地抑制血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖，赵学军等认为理脾化痰方防治早期AS的机制与抑制VSMC的增殖和过高水平的凋亡有关，徐风芹等报道芎芍胶囊含药血清对VSMC增殖有明显抑制作用。有研究显示罗格列酮能阻滞PDGF诱导的小鼠冠状动脉VSMC的趋化，减少MMP-9的产生，抑制VSMC的迁移，Collin等研究证实罗格列酮可部分抑制低密度脂蛋白受体缺陷型纯合子(LDLR－/－－)小鼠动脉硬化过程。由此推测，应用痰瘀共治方和罗格列酮灌胃治疗后PPARγ被激活，大鼠主动脉粥样硬化斑块消退，VSMC的增殖与迁移减少，单核一巨噬细胞源性泡沫细胞减少，故PPARγ蛋白表达明显降低。
马杰等指出在探讨某个方药改善AS作用机制的时候还可以从炎症因子、免疫指标等多方面来评价，笔者研究也注意到，各治疗组大鼠AS斑块病变的程度较模型组明显减轻、消退，其中以痰瘀共治高剂量组变化最明显，提示痰瘀共治方通过激活PPARγ改善胰岛素抵抗发挥抗动脉粥样硬化作用的同时，是否尚存在调节脂质代谢、抗氧化、保护内皮功能、抑制血管平滑肌细胞增生、抑制血小板聚集、促进纤维蛋白溶解、抗炎等其他多种途径，这方面的工作有待于进一步深入探讨，并将为中医药防治AS提供更先进、更科学的理论依据。
