【乙酰肝素酶和核因子－κＢ在原发性膜性肾病患者肾小球内的表达及意义】 硫酸乙酰肝素

　　[摘要] 目的：探讨乙酰肝素酶（heparanase，Hpa）和核因子-κB（NF-κB）在原发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）患者肾小球中的表达与蛋白尿、血肌酐的关系。方法：用免疫组化法检测36例IMN患者与6例正常对照者肾小球内Hpa和NF-κB的表达情况。结果：Hpa和NF-κB在对照组正常肾组织的肾小球基底膜及肾小管上皮细胞仅有少量表达；在IMN组肾小球基底膜及肾小管上皮细胞的表达较对照组均明显增强（P0.05)。IMN组肾小球内Hpa、NF-κB与24 h尿蛋白定量存在正相关关系（P0.05). The expressions of Hpa and NF-κB positively correlated with the urine protein quantitation in 24 hours; moreover the expressions of Hpa and NF-κB did not correlate with serum creatinine. Hpa positively correlated with NF-κB. Conclusion: The abnormal expressions of NF-κB and Hpa may correlate with the renal pathology and the development of proteinuria in patients with IMN; there were correlation between Hpa and NF-κB. The result of the experiment provides evidence for the therapy of IMN, namely, down-regulation of NF-κB and Hpa was good for the recovery of IMN.
　　[Key words] Idiopathic membranous nephropathy; Heparanase; Nuclear factor-κB; Urine protein
　　
　　乙酰肝素酶（heparanase，Hpa）是一种葡糖苷酸内切酶，可水解乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）。HSPG的减少可导致GBM的选择通透性改变以及肾小球上皮细胞和内皮细胞锚连位点的丧失，同时释放多种生长因子，包括成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）、血管内皮生长因子（VEGF）等[1~6]。核因子-κB（NF-κB）是一种具有多向性调节作用的核转录因子，与多种基因特别是免疫炎症相关基因的转录调节密切相关[7，9]。鉴于上述两个因子的作用尚未定论，且无两种因子在IMN患者肾小球内表达变化及其意义的系统报道，我们采用免疫组化的方法同步检测Hpa、NF-κB在IMN患者肾小球内的表达情况，以了解Hpa、NF-κB之间的关系及其对IMN的影响，为IMN的治疗提供依据。
　　
　　1 对象与方法
　　
　　1.1 一般资料
　　病例来源于2005年11月~2007年8月在本院肾内科病房诊治的36例原发性膜性肾病患者，所有患者均为首次经临床和病理检查确诊者。6例正常对照肾组织来自因肾脏良性肿瘤行一侧肾脏切除术患者的远离病灶的正常肾组织。
　　1.1.1 入选标准IMN患者肾组织标本切片后分别经HE、PAS、MASSON及MASSOM+PASM染色，在光镜下可见肾小球上皮下嗜复红蛋白沉积，肾小球基底膜表现弥漫均匀增厚、空泡变、钉突形成、或链环样改变等；免疫荧光可见IgG、C3沿肾小球毛细血管袢沉积；电镜下可见足细胞下电子致密物沉积。
　　1.1.2 排除标准 结缔组织病、肝炎病毒、慢性肝炎、恶性实体肿瘤等相关性IMN患者，肾穿刺活检前曾服用过皮质类固醇激素、细胞毒药物、他汀类降脂药物、血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）及血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）类药物的IMN患者。
　　1.2 分组方法
　　1.2.1实验组（IMN组）36例IMN患者，男21例，女15例，平均年龄43岁。IMN组根据病理改变分期再分为两个亚组，其中Ⅰ期IMN组30例，男18例，女12例，平均年龄45岁；Ⅱ期IMN组6例，男3例，女3例，平均年龄33岁。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　1.2.2 对照组6例因肾脏良性肿瘤行一侧肾切除术患者，其中男5例，女1例，平均年龄46岁，肾组织标本取自远离病灶周围的正常肾组织。
　　1.3 临床观察指标
　　血清肌酐、白蛋白、血脂、免疫球蛋白及补体；尿沉渣、24 h尿蛋白定量。
　　1.4 免疫组化检查
　　按SP法进行。肾组织切片3 μm，常规脱蜡、水化，3% H2O2 室温下孵育。0.1 mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）中行高压抗原修复。10%正常山羊血清封闭。一抗分别为兔抗人乙酰肝素酶单克隆抗体（稀释1∶75购自武汉博士德试剂公司）；兔抗人NF-κBp65单克隆抗体（稀释1∶200购自碧云天试剂公司），37℃孵育。生物素标记山羊抗兔、大鼠、小鼠和豚鼠IgG 37℃孵育。辣根酶标记链酶卵白素工作液37℃孵育。DAB显色。苏木素复染。以PBS替代一抗作为阴性对照。
　　1.5 免疫组化结果判定
　　在胞浆或胞膜处有棕黄色或棕红色颗粒状物质沉积为阳性细胞，不着色为阴性。采用北航病理图像分析系统，通过光学显微镜放大400倍摄取图像，输入图像分析系统内，对图像进行灰度变换，使阳性面积与背景分开，进行自动测量。肾小球Hpa、NF-κB免疫组化阳性面积测定：在光学显微镜计算机图像分析系统屏幕上，每例标本400倍镜下随机观察5个肾小球，分别计算每个指标的阳性面积与整个肾小球面积的比值，取其平均值作为每例标本每个指标肾小球阳性面积的比值。
　　1.6 统计学方法
　　统计学分析均采用SPSS11.0计算机软件包处理，计量资料采用均数±标准差表示，样本均数间比较采用t检验，组间比较采用方差分析，各参数间的相关性分析采用Pearson 相关分析。 P0.05）（表2）。
　　
　　2.2.2 NF-κB表达情况NF-κB在对照组正常肾组织的肾小球足细胞、系膜细胞、肾小管上皮细胞有少量表达。NF-κB在IMN患者肾小球足细胞、系膜细胞、肾小管上皮细胞有大量表达。IMNⅠ期组及Ⅱ期组与对照组比较，肾小球内NF-κB表达明显增强（P0.05）（表2）。
　　2.3 免疫组化指标与临床指标相关性分析
　　Hpa与24 h尿蛋白定量呈正相关关系，r=0.54，P 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 　　[2]Vicki L, Craig F, Chris T, et al.Heparanase is involved in the pathogenesis of proteinuria as a result of glomerulonephritis[J]. J Am Soc Nephrol,2004,15:68-78.
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　　（收稿日期：2007-08-24）
　　
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