巨菌草内生固氮菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ,ｖａｒｉｉｃｏｌａ,ＧＮ０２,ｎｉｆＨ基因的克隆及生物信息学分析

林标声　张浣星　何玉琴　罗茂春　林占熺

摘要：研究巨菌草（Pennisetum giganteum）內生固氮菌Klebsiella variicola GN02 nifH基因的生物学信息，对GN02菌株nifH基因进行克隆及完整性验证，并采用多种生物学在线软件对其进行生物信息学预测和分析。结果表明，GN02菌株nifH基因具有完整的ORF，长度882 bp，编码293个氨基酸，NCBI GenBank登录号为MK131264。生物信息学分析表明，GN02菌株nifH基因具有高度保守性，与其他物种来源的nifH基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性均达到95%以上。nifH蛋白总相对分子量为31 970.73、理论等电点pI为4.72;跨膜模型倾向N-末端向外的由内到外的跨膜、整个多肽链表现为亲水性;有2个糖基化位点但无分泌信号肽，有可能存在螺旋卷曲结构;二级结构预测表明α-螺旋和无规则卷曲是其多肽链中的主要结构元件，延伸链散布于整个蛋白质中;在数据库中能对该蛋白进行三维同源建模。

关键词：巨菌草（Pennisetum giganteum）;内生固氮菌;Klebsiella variicola;nifH基因;克隆;生物信息学

中图分类号：S543+.9;Q939.11+3         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）03-0147-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.03.033

Cloning and bioinformatics analysis on nifH gene of endophytic nitrogen-fixing bacteria

Klebsiella variicola GN02 isolated from Pennisetum giganteum

LIN Biao-sheng1，2，ZHANG Huan-xing3，HE Yu-qin1，LUO Mao-chun1，LIN Zhan-xi2，4

（1.College of Life Science，Longyan University，Longyan 364012，Fujian，China;2.College of Life Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China;3.Orlando （Hangzhou） Industrial Co.，Ltd.，Hangzhou 310051，China;4.China National Engineering Research Center of JUNCAO Technology，Fuzhou 350002，China）

Abstract：
To research the bioinformatics on the nifH gene of endophytic nitrogen-fixing bacteria Klebsiella variicola GN02 isolated from Pennisetum giganteum， the nifH gene of GN02 strain was cloned and its integrity was verified， and bioinformatics prediction and analysis of nifH gene were carried out by a variety of online biological software. The results showed that the nifH gene of GN02 strain had a complete ORF， length of 882 bp and encoded 293 amino acid， and the gene accession numbers registered in NCBI GenBank was MK131264. Bioinformatics analysis showed that the nifH gene of GN02 strain was highly conserved and had more than 95% homology with the nucleotide sequence and amino acid sequence of nifH gene from other species. The total relative molecular weight of nifH protein was 31 970.73 and the theoretical isoelectric point pI was 4.72. The transmembrane model inclined to the inward to outward transmembrane of N-end， and the whole polypeptide chain was hydrophilic. nifH protein had two glycosylation sites but no signal peptide secretion， which may had a helical crimp structure. The prediction of secondary structure showed that α-helix and irregular curl were the main structural elements in the polypeptide chain of nifH protein， and the extended chain was scattered in the whole protein. Three-dimensional homologous modeling of nifH protein can be carried out in the database.

Key words：
Pennisetum giganteum; endophytic nitrogen-fixing bacteria; Klebsiella variicola; nifH gene; cloning; bioinformatics

巨菌草（Pennisetum giganteum）隶属于狼尾草属，是福建农林大学菌草研究所于2005—2007年从南非引进、改良的一种多年生禾本科牧草[1]。巨菌草植株高大、抗逆性强、产量高，能在土地贫瘠的盐碱地、旱地、沙地等非农田生长，具有改善土质、防风、固沙的良好功能，是一种应用潜力巨大的能源草、生态草[2，3]。nifH基因是所有固氮微生物中最保守的功能基因，其作为编码固氮酶的结构基因在生物固氮过程中发挥着重要的作用[4];同时nifH基因在不同生物中广泛存在，且高度保守，因而常用于不同类型来源的固氮微生物的系统发育和多样性研究[5]。克雷伯氏菌属（Klebsiella）细菌是较早被发现和深入研究的固氮菌[6]，Klebsiella variicola GN02为克雷伯氏菌属菌株，是龙岩学院生命科学学院实验室前期从巨菌草成熟期根部分离得到1株具有高效固氮性能的内生固氮菌，其具有良好的溶磷特性，以及产氨、产铁载体、分泌抗生素等促生性能，是制备微生物复合菌肥的良好菌株来源[7]，但其固氮基因组成及与宿主巨菌草的固氮作用机制还未见相关报道。因此，本研究通过克隆GN02菌株的nifH基因，分析其基因的结构特点、生物进化地位及编码区保守性等分子生物学基本特性，并与其他来源的Klebsiella variicola进行对比分析，为进一步探讨Klebsiella variicola的生物固氮分子机制，掌握nifH基因的表达调控规律，探究Klebsiella variicola与巨菌草的互作机制提供理论基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  菌株、培养基  Klebsiella variicola GN02是由龙岩学院生命科学学院实验室从巨菌草成熟期根部分离，并经16S RNA和促生性能鉴定后在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏（CGMCC 1.13619）。

Ashby无氮培养基：甘露醇10 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaSO4·2H2O 0.1 g/L，CaCO3 5.0 g/L，pH 7.0～7.2。

1.1.2  主要试剂  DNAMarker，购自天根生化科技（北京）有限公司;各限制性内切酶、RNase A、蛋白酶K、pMD18-T载体等试剂均购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司;感受态大肠杆菌DH5α购自上海瑞楚生物科技有限公司。

1.2  方法

1.2.1  基因组DNA提取及nifH基因的克隆  取GN02菌株菌液1 mL，12 000 r/min离心1 min，弃上清;加入400 μL裂解液（1×TE，1.0%SDS）、10 μL RNase A（20 mg/mL），及10 μL蛋白酶K（20 mg/mL），涡旋混匀;55 ℃温浴至菌体完全融解;加入200 μL无水乙醇，混匀;转移全部液体至硅胶纯化柱;12 000 r/min离心1 min，弃废液;12 000 r/min离心1 min，弃废液;加入500 μL 75%乙醇;12 000 r/min离心 1 min，弃废液;加入500 μL 75%乙醇;12 000 r/min离心1 min，弃废液;12 000 r/min离心2 min，弃废液;室温干燥5 min;加入45 μL 1×TE缓冲液;12 000 r/min离心2 min，得基因组DNA溶液。

根据GenBank中登录的同源性较高物种的nifH基因的核苷酸序列设计用于扩增GN02菌株基因编码区序列的特异性引物，F：5′-TTATACTACAG GAGCTTCAG-3′;R：5′-ATGACAGACGAAAACATT AG-3′。PCR反应总体系20 nμL，其中RNase-free ddH2O 6.4 μL、DNA模板1.2 μL、Primer F（10 μmol/L）1.2 μL、Primer R（10 μmol/L）1.2 μL、2×Taq Dye PCR MasterMix 10.0 μL。PCR程序為94 ℃    8 min，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，35个循环后72 ℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物片段大小经凝胶回收纯化后将产物与pMD18-T载体连接并转化入感受态细胞DH5α上，再送至铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序。

1.2.2  nifH基因的完整性验证  通过对目的基因nifH的DNA判断进行序列测定，进一步鉴定所得的的DNA片段是否为需要的基因。根据测序所得到DNA序列的ORF及上下游序列设计引物（表1），以2条正向引物分别与3条反向引物进行6次PCR，经琼脂糖凝胶电泳验证所得的PCR产物核酸长度是否与所设计引物相符，并将所获的最长的PCR产物进行两端测序，将获得的序列与原nifH DNA序列进行比对，判定所克隆的nifH基因是否完整。

1.2.3  nifH基因的生物信息学分析  通过NCBI Blast 程序对nifH基因表达蛋白进行转化，采用各类在线分析工具分析转化后蛋白的生物学信息[8]。采用不同软件进行的生物信息学分析主要有DNAman软件分析nifH基因的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性、ProParamr分析蛋白质的理化性质、TMpred分析蛋白质的跨膜区域、ProtScale分析蛋白质的亲水性区域、Dicty Ogly分析蛋白质的糖基化位点、EMBnet COILS分析蛋白的螺旋卷曲结构、SignalP分析蛋白的信号肽、PSIPRED分析蛋白的二级结构、SWISS-MODEL预测蛋白的三维结构。

2  结果与分析

2.1  nifH基因的克隆结果

GN02菌株特异性引物PCR扩增的结果如图1所示，所扩得的nifH基因片段为882 bp，与预期扩增的片段长度一致。含目的片段的感受态细胞DH5α阳性菌落的PCR电泳如图2所示，扩增产物在880 bp左右同样出现特异性条带，表明外源nifH目的基因片段已被成功克隆。

2.2  序列测定及nifH基因完整性验证

序列测定的结果如图3所示，该序列全长1 279 bp，经DNAMAN软件和ORF Finder分析表明，该序列含有1个完整的ORF，长度882 bp，起始于225 bp，以ATG为起始密码子，终止于1 106 bp，以TGA为终止密码子，编码293个氨基酸，5′UTR长224 bp，位于1～224 bp，3′UTR长173 bp，位于1 107～1 279 bp，该基因已在NCBI登录，登录号为Klebsiella.sqn Klebsiella MK131264。

2条正向引物分别与3条反向引物进行6次PCR的琼脂糖凝胶电泳如图4所示，各PCR产物的核酸长度与所设计引物相符。将获得的最长PCR产物3进行两端测序，获得序列含nifH基因完整的ORF及部分上下游序列，与原nifH DNA序列比对结果一致，表明所克隆的nifH基因完整，可进行下一步的生物信息学分析。

2.3  nifH基因的生物信息学分析

nifH基因的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性分析如图5、图6所示。巨菌草内生固氮菌Klebsiella variicola GN02的nifH基因具有高度保守性，与其他来源的nifH基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达到了95%以上。其中GN02 nifH基因的核苷酸序列与甘蔗来源的nifH基因（CP0092742_Klebsiella_variicol_strain_DX120E）的核苷酸序列同源性最高，推测原因可能是巨菌草和甘蔗均同属于禾本科属植物，其内生固氮菌的菌群组成、定殖部位及定殖方式更为接近，所以两者固氮基因组成也更为相近[9]。GN02菌株与其他物种来源的nifH基因编码的氨基酸序列同源性很高，特别是其与医学上肠杆菌科（WP_004203553.1 Enterobacteriaceae）来源nifH基因编码的氨基酸序列同源性最高，表明两者具有一定的遗传相关性，GN02菌株在农业上应用前需要进行进一步的致病性分析。

nifH蛋白经ProParamr在线工具分析表明，该基因的293个氨基酸中，总相对分子量为31 970.73，理论等电点pI为4.72;负电荷氨基酸（Asp+Glu）45个，正电荷氨基酸（Arg+Lys）30个;分子式C1 382H2 246N376O442S24;原子总数4 470;该蛋白不含任何Trp残基，摩尔消光系数0.854（胱氨酸全按半胱氨酸计）;半衰期30 h（哺乳动物网织红细胞，在体外）、>20 h（酵母，体内）、>10 h（大腸杆菌，体内）;该酶蛋白不稳定性参数35.02，属于稳定蛋白;其脂肪系数88.57;平均亲水性（GRAVY）为-0.112，预测该蛋白为水溶性蛋白。

运用TMpred在线工具对nifH蛋白进行跨膜区预测分析，以分值大于500作为参考，结果如图7所示，nifH蛋白有一个跨膜区段，其跨膜结构的位置为122～138，长度为17个氨基酸，分值为580，其跨膜模型倾向N-末端向外的由内到外的跨膜。

采用ProtScale分析nifH蛋白质的亲水性区域，以0为参考，大于0为疏水区，值越大，疏水性越强;小于0为亲水区，值越小，亲水性越强。所得结果如图8所示，多肽链第106位的氨基酸具有最高分值1.889，疏水性最强;第191位的氨基酸具有最低分值-3.156，亲水性最强。整体上看，多肽链的亲水性区域均匀地分布在整个肽链中，略多于疏水性氨基酸，可认为整个多肽链表现为亲水性。

蛋白质的糖基化位点分析如图9所示，当P大于阙值时，认为该蛋白具有糖基化位点。结果表明，nifH蛋白共只有2个糖基化位点，分别位于第164和第250位点的丝氨酸（Ser），表明nifH蛋白基本上不可能存在信号肽和成为分泌蛋白的可能，而没有信号肽的蛋白质不太可能暴露在N-糖基化机制中，因此即使它们含有潜在的基序，也不可能在体内被糖基化。

采用EMBnet COILS在线工具对nifH蛋白的螺旋卷曲结构进行分析，以Window为14、21和28作为参考值。结果如图10所示，nifH蛋白的氨基酸序列在47～74和218～255两个区域最有可能存在螺旋卷曲结构，特别是47～74的可能性最大。

信号肽分析有助于蛋白质功能域的区分。nifH蛋白经SignalP在线工具分析结果如图11所示，获得ORF的Cmax为0.119、Ymax为0.161、Smax为0.333、Smean为0.239，前三个值的位点分别在26、17、11。根据软件的默认选择，将Cmax>0.5和Smean>0.5的ORF确定为具有信号肽。根据分析结果，此信号肽计算结论为NO，表示没有信号肽存在，表明nifH蛋白为非分泌蛋白。

采用PSIPRED在线工具分析了nifH蛋白的二级结构，结果如图12所示，nifH蛋白主要由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成，其氨基酸个数和占比分别为110个和37.54%、41个和13.99%、142个和48.46%。表明α-螺旋和无规则卷曲是nifH蛋白多肽链中的主要结构元件，延伸链散布于整个蛋白质中。

采用SWISS-MODEL在线工具对nifH蛋白的三维结构进行分析预测，所构建的三维结构如图13所示。结果表明，nifH蛋白序列与数据库中X晶体衍射（分辨率2.10？魡）结构相似度达53%。