小反刍兽疫研究进展

　小反刍兽疫研究进展

　　摘要：小反刍兽疫（Pestedespefitsnuninants，PPR）是OIE规定的A类烈性传染病，我国规定为一类动物疫病，是一种严重的烈性、接触性传染病，主要感染小反刍兽，特别是山羊高度易感，别的野生动物也可发生。近年来该病呈蔓延的趋势，2007年7月25日西藏自治区日土县暴发了我国首例小反刍兽疫疫情，中国动物卫生与流行病学中心确诊了这一疫病。该病作为一种重大的跨国动物疫病，严重的威胁我国的动物卫生安全，对该病开展研究具有重要的现实意义。就该病的病原学、流行病学、诊断、预防及控制等研究进展进行了综述。

　　关键词：小反刍兽疫；小反刍兽疫病毒；病原学；流行病学；临床症状；诊断；预防；控制

　　中图分类号：S854文献标识码：B文章编号：1007-273X（2013）01-0074-04

　　小反刍兽疫又称小反刍兽假性牛瘟、肺肠炎、口炎肺肠炎综合征等，是由副粘病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属（Morbolivirus）的小反刍兽疫病毒（PestedesPetitsRuminantsvirus，PPRV）引起的，主要感染小反刍兽，特别是山羊和绵羊高度易感，野生动物也偶然发生，是一种严重的烈性、接触性传染病，目前无感染人的报道。该病发病率和死亡率分别高达100%和50%，世界粮农组织（FAO）和世界动物卫生组织（OIE）规定小反刍兽疫为A类传染病，我国规定为Ⅰ类动物疫病[1]。该病流行于非洲的赤道到撒哈拉地区、大部分中东国家和印度、尼泊尔等与我国接壤的南亚国家，近年来呈蔓延的趋势[2]。

　　PPRV于1942年在西非科特迪瓦首次发现，随后非洲的一些国家相继发生如尼日利亚、塞内加尔等。近年来，小反刍兽疫（PPR）呈扩散的趋势，成为重要的跨国动物传染病之一，并且我国周边国家频繁暴发该病，2007年7月，我国西藏自治区阿里地区日土县发生小反刍兽疫疫情，死亡262只山羊和绵羊[3]。随后那曲地区也暴发小反刍兽疫，国家有关部门遵循《中华人民共和国动物防疫法》、《国家突发重大动物疫情应急预案》和《重大动物疫情应急条例》等国家控制重大动物传染病的相关法律法规进行及时检测、疫情报告、扑灭等综合控制措施。这是我国首次发生小反刍兽疫，作为一种重大的动物疫病，小反刍兽疫严重威胁着我国的动物卫生安全和我国畜牧业的发展，是需要采取严厉的强制预防控制和扑灭的动物疫病之一。该病对我国的动物卫生健康已产生严重的威胁，因此在我国PPR还没有开始大规模流行时，对该病展开研究就显得十分重要。

　　1病毒学

　　1.1病毒的形态特征

　　小反刍兽疫病毒（PPRV）与牛瘟病毒（RPV）、犬瘟热病毒（CDV）、海豹瘟病毒（PDV）、海豚瘟病毒（DDV）、牛麻疹病毒（MV-K1）和人麻疹病毒（MV）等同属于副粘病毒科（Paramyxoviriade）的麻疹病毒属（Morbollivirus）成员，PPRV病毒粒子多呈圆形或椭圆形，直径约为130～390nm。病毒颗粒的外有囊膜，囊膜上有纤突，病毒的纤突中只有血凝素（H）蛋白，而没有神经氨酸酶。

　　1.2病毒理化特征

　　PPRV病毒粒子对外界环境敏感，37℃条件下，PPRV感染力的半衰期为1～3h。病毒粒子在pH5.8～11.0时稳定，对酒精、乙醚、甘油和一些去垢剂敏感，大多数的化学灭活剂如酚类、2%的NaOH等作用24h可以灭活该病毒。使用非离子去垢剂可使病毒的纤突脱落，降低感染力。

　　1.3PPRV分子生物学特性

　　PPRV病毒粒子虽然含有血凝素蛋白，但是不能对猴、牛、绵羊、山羊、马、猪、犬、豚鼠等大多数哺乳动物和禽的红细胞具有凝集性。也有研究表明，PPRV抗体可以抑制麻疹病毒对猴红细胞的凝集作用。

　　PPRV基因组由单股负链无节段RNA组成，RNA链从3’至5’依次分布着N-P-M-F-H-L6个基因，编码相应的6种主要结构蛋白分别编码核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、囊膜基质蛋白（M）、纤突糖蛋白（F）、血凝素（H）和大蛋白（L）6种结构蛋白，此外，P基因还编码C和V2种非结构蛋白[4]。N蛋白由N基因编码，包含一个开放的阅读框架（ORF），编码525个氨基酸残基，N蛋白含有位点，能够诱导产生受I型MHC分子限制的CTL反应。P蛋白在RNA聚合酶复合物中作为辅助因子与L蛋白相结合，使L蛋白很好地折叠。P蛋白和核衣壳蛋白结合可维持后者在细胞质中的可溶状态中，从而阻止其不正常装配或与非特异RNA结合。P蛋白最不保守。M蛋白形成病毒囊膜的内层，在成熟病毒粒子从细胞内释放的过程中，M蛋白发挥了决定性的作用。当M蛋白缺损时，病毒不能持久稳定的发挥感染细胞的功能。F蛋白是一种融合蛋白，含546个氨基酸，参与病毒介导的溶血、细胞融合和感染的开始。H蛋白构成病毒的另一种纤突，同时具有血凝素和神经氨酸酶活性，它具有较高的变异性，含有T细胞抗原决定簇。

　　2流行病学

　　2.1易感动物

　　该病自然发病主要见于绵羊和山羊，但山羊发病较严重，引起体重下降，同时有品种间发病倾向性。绵羊偶有严重病例，黄牛、猪与发病的山羊同居不感染。

　　2.2地理分布

　　根据OIE和FAO（1999）的公报，在位于大西洋和红海之间的大多数非洲国家证实已经感染PPR，感染的地区向北扩展到埃及，向南扩展到肯尼亚，向东扩展到加蓬。近年，PPR传播到在近东地区和阿拉伯半岛，包括伊朗、伊拉克、以色列等10个国家和地区。现在，与我国接壤的南亚地区：印度、尼泊尔、孟加拉国、巴基斯担和阿富汗也暴发了PPR。

　　2.3传播途径

　　该病在易感动物之间可以通过直接接触的传播或间接的传播；容易在多雨的季节和干燥寒冷的季节多发。

　　3发病机理

　PPRV和其他麻疹病毒属的致病性相似，具有趋淋巴和趋上皮性。因此，它在动物体的淋巴组织和上皮组织中最容易复制，对这些组织的伤害也最为严重，呼吸道可能是病毒进入机体的门户，病毒通过呼吸道进入机体后，首先在咽喉、下颌淋巴结以及扁桃体复制，2～3d形成病毒血症，随后的2～3d首次出现临床症状。病毒血症导致病毒到达全身的淋巴器官脾脏、骨髓和胃肠道及呼吸系统的黏膜继续增殖[5]。

　　4临床症状和病理变化

　　4.1临床症状

　　根据临床症状PPR分为3个型：最急性型、急性型和温和型[6]。

　　4.1.1最急性型多见于幼龄羊，潜伏期仅有2d，表现为体温升高（41～43℃），很快表现精神沉郁、被毛逆立、食饮欲减退或废绝，口腔和眼睛流出黏液性分泌物。疾病第一天可见便秘，紧接着非常快地出现水样腹泻，整个病程自出现体温升高到死亡不超过5～6d，最急性型没有明显的临床症状，死亡率可达100%。

　　4.1.2急性型与牛瘟具有相似的临床症状，潜伏期3～4d。初期，与最急性型表现相似，缺乏明显症状。表现为发热急，高达41℃以上，可持续3～5d，发热1～2d后，患病动物精神沉郁、食饮欲减退或废绝、鼻镜干燥，嘴和眼黏膜潮红，嘴唇、面颊内面和舌面上部因黏膜坏死而出现针尖大小的灰色区域，呈弥漫性分布。继而眼睛、鼻子和口腔分泌大量黏液并逐渐变成黄色脓性黏稠状。分泌物使上腭和眼下被毛潮湿，干燥后使眼睑黏连，堵塞鼻孔，导致呼吸困难，可出现眼炎，有的甚至失明。后期出现口腔黏膜充血、溃疡，覆盖白色的坏死组织被死亡的细胞覆盖，以至口腔黏膜完全被厚的干酪样物质附着。用手指在牙床和上腭轻轻摩擦，可采到含有病理组织碎片的有恶臭气味的物质。发病后期常出现出血性腹泻，开始时粪便变软，然后水便，有时含有内脏组织坏死碎片和血液。随之动物脱水、衰弱、呼吸困难、鼻孔开张，舌伸出，体温下降，眼球凹陷，常在发病后5～10d脱水而死，咳嗽、胸部罗啰以及腹式呼吸也常发生，表现出肺炎症状[7]。一个常见的特点是，疾病的晚期在鼻、口周围有小结节形成，但确切的原因还不清楚。

　　4.1.3温和型不表现明显的临床症状，轻微短暂的发热，有时可见眼睛和鼻腔流出大量的分泌物，并在鼻孔周围结痂。

　　4.2病理变化

　　病变与牛瘟相似，眼部可见结膜炎，弥散性卡他性炎症。肠炎，胃肠道大面积坏死，糜烂性损伤从嘴延伸到瘤胃、网胃交接处；皱胃呈有规则、有轮廓的糜烂，刨面红色出血；小肠一般有中度损伤，呈现有限的出血性条纹；大肠、盲肠、结肠有小的红色出血点，时间稍长汇合在一起，呈现“斑马纹”样特征性线状条纹。支气管和肺脏出现干酪样病灶，肺脏表面、支气管黏膜等有出血点。所有上皮组织的多核巨细胞（合胞体）和淋巴结一样能够观察到感染，脾脏、扁桃体和淋巴结可见核固缩和核破裂导致淋巴细胞坏死。在舌唇和软腭出现包涵体，在肺炎肺泡腔出现合胞体细胞，支气管上皮细胞内出现胞浆包涵体，PPRV对淋巴细胞和上皮细胞有特殊的亲和性，一般能在上皮细胞和多核巨细胞中形成具有特征性的嗜伊红胞浆包涵体。淋巴细胞和上皮细胞坏死，具有诊断价值。

　　5诊断方法

　　目前，已经研究出许多检测方法针对PPRV感染的诊断。这些方法包括琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）、免疫荧光抗体试验（IFAT）和病毒中和实验（VN）等。随着免疫学和分子生物学的发展，已经研制出许多种酶联免疫吸附试验和分子生物学检测方法，也是近几年国外应用的主要检测方法，其中C-ELISA和PCR方法已经成为OIE规定的检测标准方法。

　　5.1初步诊断

　　根据动物发病的流行病学特点、病畜的临床症状以及病理解剖变化等特点可以进行初步诊断。但是必须注意牛瘟（RP）、口蹄疫（FMD）、蓝舌病（BT）、山羊传染性胸膜肺炎、巴氏杆菌性肺炎等疾病的鉴别诊断。

　　5.2实验室诊断

　　5.2.1样品采集实验室样品可以采集病畜的眼下结膜、鼻腔以及直肠黏膜等部位的分泌物棉拭子，也可采集凝固的血液或加抗凝剂的全血。病畜剖解后可无菌采集有典型病变的组织样品，如肠系膜或支气管淋巴结以及肺脏、脾脏、扁桃体等器官组织[8]。

　　5.2.2病毒的分离样品采集后可以用原代羔羊肾细胞或非洲绿猴肾细胞（Vero）进行分离培养病毒。PPRV产生的CPE要在接种细胞培养后的5～6d才能够出现，具体表现为细胞变圆、收缩，形成多核巨细胞体，有的出现核内包涵体，部分细胞形成空泡。由于CPE出现的较慢，需要一定时间，所以一般在细胞培养4～5d后应进行盲传继代。

　　5.2.3琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）该试验所用的标准PPR病毒抗原是由肠系膜或支气管淋巴结、脾脏或肺组织材料加一定的缓冲液配制而成；所用的标准抗血清是以5mL含有104TCID50/mL的PPRV高免绵羊，每周注射一次，连续注射4周。在最后一次注射后5～7d时采血，提取血清制备而成的。Obitu等采用PPRV的细胞适应毒接种兔子制备的抗PPRV高免血清进行AGID试验，能够与麻疹病毒属的其他3种病毒发生交叉反应，但是如果将其进行1︰100稀释以后，则仅和其同源的PPRV呈阳性反应。这是一种相对简单、快速和廉价的检测方法。但是它的敏感性较低，不能检测微量抗原，因此也就不能对疾病作出早期诊断[9]。

　　5.2.4间接免疫荧光抗体试验（IFAT）据报道，应用PPRV的特异性单克隆抗体建立了间接荧光抗体检测方法，能够检测出PPR感染发病的早期和后期病料中的病毒抗原，并且这种方法能够快速对PPR和RP进行鉴别诊断。

　　5.2.5病毒中和试验（VN）VN具有很强的特异性。可以鉴别PPRV和RPV，也可以鉴别PPRV的不同毒株之间的差异。但是VN也存在明显的不足：耗费时间较长，一般需要10～12d才能得到结果；需要细胞培养病毒及无菌的试验样品；浪费人力，很难实现大规模样品的监测。因此这种方法在野外条件下，尤其在发展中国家使用起来十分的不便。

　5.2.6酶联免疫吸附试验（ELISA）应用ELISA方法监测血清的方法已经十分的成熟，而且有多种试验方法。间接ELISA方法就是将抗原吸附在酶标板上，然后加入PPRV的病毒特异性血清孵育，最后加入酶结合物和底物监测血清中的特异性抗体。这种方法容易受到待检材料中的其他蛋白的干扰。针对这一问题，应用免疫捕获ELISA（夹心ELISA）方法可以更为精确的检测，即将待检样品首先和特异性抗体反应形成免疫复合物，这种复合物随后被预先包被在酶标板上的二抗（捕获抗体）所结合，再按常规的方法加酶结合物和底物等进

　　行[10]。

　　6国内外研究进展

　　6.1国内研究发展现状

　　我国对小反刍兽疫病的研究还处于起步阶段。最近几年，随着SARS、禽流感等几次大规模国际性人畜传染病的暴发，PPR在我国周边地区的蔓延引起了国内的重视。近年来，中国检疫检验科学研究院、云南出人境检验检疫局、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心等单位开展了相关的研究，主要是以检验检疫技术为主，建立了RT-PCR检测小反刍兽疫病毒核酸的方法和进行N、H基因的克隆和原核以及真核表达。其后又在此基础上引入了巢式PCR技术，在第一次PCR产物的基础上进行二次PCR，提高了反应的特异性。

　　6.2国际研究发展现状

　　最近几年国际上在小反刍兽疫方面的研究取得了长足发展，以英国动物健康研究所、印度新德里和班加罗尔的几个研究所为代表的研究机构，先后发表了数十篇相关论文。英国科学家Bailey等公布了第一个小反刍兽疫病毒的全基因序列，并发现PPRV在核酸水平上与RPV非常相似，但在多肽结构上却更接近于DMV，这为构建感染性克隆、基因功能组学、PCR引物设计，病理学研究奠定了基础。韩国科学家于2005年，利用单克隆抗体和缺失变异株对PPRV核衣壳蛋白（N蛋白）的抗原表位进行了分析，最终确定4个抗原性区域（A—I，A一Ⅱ，C-I，C-II）。有学者研究发现Marmo-setB95a细胞可以替代Vero细胞来增殖PPRV。MarmosetB95a是一种E-B病毒改造的狨猴B淋巴细胞的衍生细胞系，它比一般所用的Vero细胞更利于麻疹病毒属的繁殖与分离，这对于PPRV的研究是一件非常有用的工具。

　　7PPR的控制与预防

　　控制小反刍兽疫在我国的传播应从传染源、传播途径及易感动物三个方面入手。目前传染源主要是在国外和我国的西藏地区，因此当前控制小反刍兽疫在我国大范围内暴发是首要的任务。在疫区周围设立警示标志，在出入疫区的交通路口设置动物检疫消毒站，对出入的人员和车辆进行消毒；必要时，可设立临时监督检查站，执行监督检查任务。动物检疫消毒站和临时监督检查站应按照国家有关规定规范设置。

　　目前，世界各国对PPR的治疗仍无有效的方法，对于已经发病的动物可以采用土霉素、四环素等抗生素以及磺胺类药物进行辅助治疗，以防止细菌等微生物的继发感染。对于发病的疫区，再用高免血清进行紧急被动免疫以减少疾病的传播。对于从未发生过PPR的国家和地区，应立即采取封锁隔离措施，快速建立疫区隔离带，扑杀已感染的动物，再进行彻底消毒处理。防制PPR的主要措施就是进行疫苗免疫接种。由于PPRV和RPV之间的抗原相关性很强，可用RP组织培养的疫苗对绵羊、山羊进行免疫，产生的抗RP抗体能够很好的抵抗PPR野毒株的攻击，但是这种方法不利于全球牛瘟消灭计划的实施。

　　因此，有研究人员利用基因反向遗传技术成功研究出PPRV/RPV的嵌合体疫苗，即利用PPRV的糖蛋白基因取代RPV表面的相应糖蛋白基因。这种方法构建的疫苗，对PPRV能够产生良好的免疫原性，而且用ELISA方法不能检出免疫血清中RPV非抗体，也有助于对这两种疾病进行血清学监控。由于我国已经发生PPR疫情，必须做好边界接壤地区的动物检疫，各口岸对进境的动物也要严格检疫，发现感染动物必须立即隔离扑杀、焚烧尸体，进行彻底消毒处理。纵观国内外研究现状，对于小反刍兽疫经典的常规诊断方法已经十分成熟，目前常用的ELISA方法和分子生物学的诊断方法也已经建立，并且都已成功开发了相关的试剂盒。涉及到病原微生物方面的相关研究比较困难，且需要在P3级以上的生物安全实验室才可以进行。因此建立一个方便、快速、安全、敏感、特异的检测方法对于该病的研究和预防控制具有极其重要的意义。

　　8当前存在的问题及展望

　　长期以来，人们一直认为PPRV是RPV的变异毒株，只是丧失了对牛的致病力，而仅对小反刍兽有致病作用，加上RP和PPR能够产生交叉免疫保护，可以用RP疫苗预防PPR。因此，在很多国家和地区忽略了对PPR的研究，特别是忽视了PPRV的生物学特性、分子生物学等方面的研究。印度就曾发生过因牛接种RP活疫苗导致羊暴发小反刍兽疫的疫情。用高免血清进行被动免疫在疫病发生时可减少疫病的传播，但是对已发病的病畜无作用。因此，当前必须积极加强对PPRV的基础研究，尤其是基因组变异特性的研究，同时加强对该病的流行病学检测，进一步明晰致病机理，建立高效、快速的病原检测新方法以及防治等研究，特别是要加强对PPR的免疫机理研究和加强PPR疫苗研究工作，例如高效疫苗株筛选、基因重组疫苗等，早日开发出有效的疫苗，为有效防控乃至最终消灭小反刍兽疫奠定理论基础。

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