大黄解热作用与降低血浆一氧化氮作用的PK—PD研究

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[摘要]： 药动学与药效学模型的结合是现代药物研究方法的一个热点，也是评价中药作用的一个重要手段。该文以内毒素复制大鼠发热炎症模型，灌胃大黄水煎液（1.54 g·kg-1）后不同时间点采血，测量体温及血浆NO浓度，同时采用高效液相色谱-荧光法（HPLC-FLD）进行大黄酸血药浓度测定。以Kinetica 5.0.11软件，分别对治疗组大黄酸平均血药浓度与治疗组体温及NO降低值进行PK-PD模型拟合，评价大黄作用特点及可能机制。实验结果表明大黄能够抑制LPS大鼠体温及血浆NO浓度的升高；最终PK-PD模型均以效应室联结的无滞后时间二房室-Sigmod Emax拟合较优；大黄酸在LPS大鼠体内的t1/2，Cmax，AUC与正常大鼠比较显著增大；大黄解热及降低血浆NO浓度的EC50分别为114.1，90.80 μg·L-1，两者较为接近；解热作用Emax约为造模后体温升高最大值的111.0%，对NO影响的Emax约为造模后血浆NO升高最大值的8.399%，两者有显著差异；两药效指标的药效动力学曲线均较为陡峭。大黄在正常及LPS大鼠体内的药物动力学过程存在差异；解热及降低血浆NO浓度的作用靶点可能处于同一部位；大黄解热作用机制除通过降低血浆NO浓度外，应具有其他微观作用机制；大黄解热和降低血浆NO浓度作用的量效关系范围较窄，效能较低。

[关键词]： 大黄酸；一氧化氮；体温；药动学-药效学结合模型

[稿件编号] 20121126009

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81073118，8100168）；四川省教育厅自然基金重点项目（11ZA061）

[通信作者] *王平，副教授， E-mail：viviansector@yahoo.com.cn

[作者简介] 李红，硕士研究生，Tel：15882232967，E-mail：lh1989manager@126.com

大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄R. tanguticum Maxim. ex Balf.或药用大黄R. officinale Baill.的干燥根及根茎， 具有泻下攻积、清热解毒的功效[1]。现代药理学研究认为大黄具有一定的抗内毒素作用[2]，能够治疗细菌内毒素引起的多种感染性疾病。在内毒素炎症反应中常常伴有体温升高的症状，体温是观察内毒素感染最宏观、最直接的指标[3]。体内外实验均证实，在大黄抗内毒素入血的有效组分蒽醌类化合物中以大黄酸的含量最高，并且大黄酸的前药能够明显抑制炎症的发展以及血浆NO的升高[4-5]，而NO常常作为某一抗炎药物抗炎活性的检测指标[6]。因此研究大黄酸血药浓度与NO及体温变化的关系对于阐明大黄抗内毒素作用强度及可能的作用机制等有着重要的意义，但目前仍未见相关报道。

1979年，Sheiner等[7]在传统药动学（PK）-药效学（PD）模型基础上提出了效应室的概念，该模型更好的解释了某些药物效应滞后于血药浓度的现象，提示了药物产生药理效应可能是一种间接的作用方式，对于预测药物药理效应完整的时间过程具有临床意义[8]。PK-PD模型中PD部份主要有线性、对数线性、Emax以及Sigmod-Emax模型，动力学部份较多采用房室模型，两者可采用效应室等联结[9]。本实验是在上述模型理论的基础上，研究大黄中主要成分大黄酸对内毒素大鼠体温及血浆NO浓度影响的药动学与药效学关系，以揭示其可能的作用强度与相关机制。

1 材料

1.1 试剂与仪器 内毒素（LPS，Sigma L2880-100MG）， 一氧化氮试剂盒（硝酸还原法）购于南京建成生物工程研究所，甲醇（色谱纯，Fisher scientific LOT：111270），乙腈（色谱纯，Fisher scientific LOT：096318），乙醚为分析纯，大黄酸对照品购置中国食品药品检定研究院；Varioskan全波长多功能酶标仪（Thermo Fisher Scientific）、高效液相色谱仪（Agilent Technologies 1260 Infinity）、电子体温计（深圳市日精实业发展有限公司）、涡旋仪（上海沪西分析仪器有限公司）、电子天平（BS323S型）。

1.2 药物 大黄药材购自北京本草方源药业有限公司（生产批号20100806），经成都中医药大学民族药学院古锐副研究员鉴定为药用大黄的干燥根及根茎。取药材加入10倍量的蒸馏水浸泡30 min，武火煮沸，文火煎煮40 min，滤液浓缩致原生药1 g·mL-1。

1.3 动物 健康SD大鼠，雄性，体重（220±20） g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，动物许可证号SCXK（川）2009-124。

2 方法

2.1 分组与给药 雄性SD大鼠24只，随机分为正常对照组、模型对照组、大黄对照组和大黄治疗组，每组6只动物，实验前禁食不禁水12 h。各组给药如下：大黄治疗组尾静脉注射内毒素100 μg·kg-1，30 min后灌胃给予大黄水煎液1.54 g·kg-1；大黄对照组尾静脉注射等体积的生理盐水，30 min后灌胃给予大黄水煎液1.54 g·kg-1；模型对照组尾静脉注射内毒素100 μg·kg-1，30 min后灌胃给予等体积生理盐水；正常对照组尾静脉注射等体积的生理盐水，30 min后灌胃给予等体积生理盐水。

2.2 药效学指标检测 各组大鼠每只均在实验前测定2次正常体温，以平均值作为其基础体温；灌胃给药后分别在2，5，15，30，45 min以及1，2，4，6，8，12 h的时间点测定体温并眼眶采血0.3 mL，置于肝素化离心管，温浴30 min后，3 500 r·min-1离心10 min，按试剂盒说明书方法检测血浆NO浓度。

2.3 大黄酸血药浓度测试 取50 μL血浆参照文献处理后[10]采用高效液相色谱-荧光法（HPLC-FLD）进行测试。色谱柱Capcell PAK C18， MGⅡ（2.0 mm×100 mm，3 μm），流动相0.2%甲酸水溶液（A）-20%甲醇-乙腈（B） 46∶54，激发波长440 nm，发射波长520 nm，流速0.25 mL·min-1，柱温40 ℃。

2.4 数据分析 PK-PD模型拟合采用Kinetica 5.0.11（热电公司授权成都中医药大学药学院使用）进行。需进行组间检验的数据以±s表示，采用Maple15（Maple公司授权成都中医药大学药学院使用）软件进行统计学处理，组间差异比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齐者组间比较用LSD检验，方差不齐者用Tamhane′s T2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2.5 药动学模型 动力学个体数据采用非房室分析法，求算相应参数，并求算各组动力学参数的平均值和标准误，并对大黄对照组和大黄治疗组进行比较；大黄治疗组大黄酸平均血药浓度采用房室分析法，比较一、二、三房室模型及有无滞后时间的拟合优度，以拟合优度最高的模型与PD模型进行联结。

2.6 实验数据预处理 求算温度以及血浆NO浓度组内平均值，最终药效以相对于模型对照组的指标差值表示，按以下公式，分别计算大黄解热及降低血浆NO的作用，并带入药效学模型计算。

ΔT=T大黄治疗组-T大黄对照组

ΔNO=NO大黄治疗组-NO大黄对照组

2.7 PD及PK-PD模型的建立 分别直接或间接联结线性、对数线性、Emax以及Sigmod Emax PD模型与大黄酸房室PK模型，以有效应室的间接联结为主，采用列文伯格-马夸尔特（Levenberg Marquardt Fitting）拟合算法计算，以Akaike criteria（AIC）为主要拟合优度参数比较各模型优度，选取最终用于联结的PD模型和PK模型。

3 结果

3.1 大黄对LPS大鼠及正常大鼠体温与NO的影响 空白对照组体温均在37.5 ℃左右，无统计学差异。模型对照组注射LPS 30 min后大鼠体温开始上升；大黄治疗组与模型对照组比较有明显的差异（P<0.05）；大黄对照组与空白对照组比较没有显著差异，见图1。注射LPS后，模型对照组血浆NO在2 h时开始有明显的升高，8 h达到高峰，各时间点与空白对照组相比均显著性增加（P<0.05）；大黄治疗组与模型对照组相比各时间点NO的含量有所降低，但是没有明显的差异；大黄对照组与正常对照组比较没有显著差异，见图1。

3.2 药动学结果 灌胃大黄水煎液后，以非房室模型计算相应的药动学参数，见表1。统计学比较表明，大黄治疗组与大黄对照组动力学过程具有显著差异（P<0.05），治疗组药时曲线下面积（AUC）升高，半衰期（t1/2）延长，平均滞留时间（MRT）增大，表明LPS能够影响大黄中大黄酸的药动学行为。

3.3 大黄酸血药浓度-效应模型的拟合 模型对照组发热出现在LPS造模0.25 h后，NO升高在造模后1 h出现。因此，以大黄酸血药浓度为X轴，分别以造模后0.25 h各时间点温度变化值、造模后1 h各时间点NO浓度变化值做Y轴建立大黄酸血药浓度-效应曲线，见图2。可见给药后大黄酸浓度2个指标变化均非线性关系，而是呈现出明显的顺时针滞后回线。

图1 大黄对LPS发热大鼠及正常大鼠体温（A）和NO（B）的影响（±s，n=6）

Fig.1 Time course of mean body temperature （A）， concentration of NO in plasma （B） after normal saline， rheum alone， LPS alone， rheum 30 min after LPS（±s，n=6）

表1 大黄治疗组与大黄对照组非房室模型药动学参数（±s，n=6）

注：与对照组相比1）P<0.05。

3.4 2种效应PK-PD模型参数的比较 拟合结果显示，PD模型均以Sigmod Emax较优，大黄酸房室PK模型以无滞后时间的二房室模型较优，因此选择Sigmod Emax模型与二房室PK模型进行效应室间接联结。2种药效的PK-PD模型拟合结果见图3。温度和NO浓度变化的PK-PD模型AIC分别为-8.357，-8.822；objective function值分别为0.065 47，0.060 59；Schwartz critria值分别为-12.77，-13.24，模型拟合较优，见表2。

A.血药浓度-温度变化曲线；B.血药浓度-NO浓度变化曲线。

图2 大黄酸血药浓度-效应曲线

Fig.2 Plasma-concentration course of Rhein of temperature（A） and NO（B）. Symbols depict actual value and lines represent the direction indicator

4 讨论

由于本实验大黄治疗组和大黄对照组需要同时测定NO和大黄酸的血药浓度，因此每只动物整体采血量较大，4 h后的动物状态可能已经处于失血或亚失血状态，极有可能对动力学消除相的真实状态造成影响。为减少这一系统误差对最终实验结论

A.大黄酸平均血药浓度二房室PK拟合曲线；B.解热作用的PD拟合曲线；C.抑制NO生成的PD拟合曲线。

图3 2种药效的PK-PD模型拟合图

Fig.3 Prediction and observe Rhein average plasma concentration vs. time profiles for two-compartment PK model （A），the antipyretic effect vs. time profiles for PD model（B），time course of NO for PD model（C）. Symbols depict actual value and lines represent the model fitting

表2 2种药效的PK-PD模型参数

的影响，实验中密切观察动物状态，予其自由的摄入糖盐水；同时，各组实验动物采血量完全相同，以形成较佳的对照控制，从而确保实验数据以及研究结果具有一定的意义。

发热是临床上最为常见的一种疾病症状，对多种疾病的发生发展起着至关重要的作用。LPS诱导的发热模型是经典的炎症发热模型，与临床感染性炎症伴有的发热症状相似，被广泛的用于炎性发热机制的探讨[11-12]。在本实验中，模型组大鼠尾静脉注射LPS后，体温明显升高，且呈二相发热体征。中医认为大黄味苦性寒，能够通肺泄腑，具有清热解毒的作用。本实验结果显示大黄对正常大鼠体温没有影响，但确能降低LPS引起的体温升高，且对2个发热高峰有较显著的抑制作用。一氧化氮是一种血管松弛因子，作为炎症反应发生和信号传导的介质，主要参与体内多种生理过程与免疫反应的调节，尤其在炎症级联反应过程中发挥着重要的作用[13-14]。在本实验中，大鼠尾静脉注射100 μg·kg-1 LPS，血浆NO在1 h后明显升高，2～8 h呈直线上升趋势，炎症反应达到了一个较高的水平，灌胃1.54 g·kg-1大黄水煎液能够抑制血浆NO的升高，与文献结果较为相似[15-16]。

体温作为LPS模型中重要的药效指标，具有客观性、连续性、可重复性及可靠性，而NO这一炎症介质的浓度为抗炎作用最为明显且较易观察的机制指标。PK-PD模型主要描述时间、药物浓度、药物效应三者之间的关系[17]。选择体温与NO 2种药效指标分别构建PK-PD模型，不但可以探讨大黄解热作用的效价、效能等宏观药效学特点，也可从NO生成角度来探讨其解热作用的微观机理。本研究最终建立了以效应室联结的无滞后时间二房室-Sigmod Emax PK-PD模型，成功的解释了大黄解热或降低血浆NO浓度作用滞后于大黄酸血药浓度的现象。PK-PD模型中效应室的出现可能与药物分布、合成新活性物质、表达新的基因所需要的时间有关[18-19]，因此带有效应室的PK-PD模型提示大黄相关药效极可能是通过调控较复杂的机体内抗炎反应而实现的。

大黄解热作用的EC50为114.1 μg·L-1，降低NO血浆浓度EC50为90.80 μg·L-1，两者较为接近，提示大黄对体温和NO调节的作用靶点可能在同一部位。本研究显示大黄酸解热作用的EC50为114.1 μg·L-1，EC50/Cmax为10.74%，这表明大黄酸由中央室转移到效应室的物质量较少，这可能与大黄酸的血浆蛋白结合率较高有关[20]。大黄解热Emax为1.283 ℃，约为模型对照组体温升高最大值（1.156 ℃）的111.0%，提示大黄解热抗炎效果是很明确的。但与化学药物而言，大黄解热作用效能仍有较大差距，如布洛芬解热效应PK-PD模型表明其Emax可达3 ℃ [21]。这也提示笔者，大黄解热作用较为温和，但是也不排除中药通过配伍应用的方式以增强最终治疗效果，因此有关配伍对药效动力学的研究值得进一步开展。对NO浓度降低的最大效应Emax为61.00 μmol·L-1，占模型对照组NO升高最大值（726.2 μmol·L-1）的8.399%，与大黄降温的相对比例（111.0%）比较，大黄对NO的作用明显弱于解热作用，二者的对比也提示大黄解热作用的微观机制可能不完全通过降低血浆NO浓度来实现。一些药效学文献研究表明，大黄解热作用也可能与IL-6[21-23]等其他因素有关，相关基于IL-6炎症因子的PK-PD研究目前正在开展。另外，陡度系数（S）表示S形Emax模型中曲线的斜率[24]，本研究中S分别为21.68，16.48，曲线斜率较大，坡度陡峭，提示大黄量效关系范围可能较窄，最低有效量与最大有效量间的差距极小，也说明增大其用量对解热等药效的增强极其有限。

综上所述，本研究通过建立宏观作用及其微观作用机制的PK-PD模型，可以定量的评价中药作用的效价强度、效能、量效关系范围及其微观机制对宏观效应产生的供献率，是中药药理学研究的重要工具，值得进一步推广和深化。

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Pharmacokinetic/pharmacodynamic modeling of antipyretic and reducing

plasma concentration of NO effects of Rheum palmatum in rat

LI Hong， ZHANG Yan， YU Yi-ping， WANG Ping *， LI Fan-fan， MENG Xian-li

（College of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

[Abstract] Pharmacokinetic-pharmacodynamic （PK-PD） modeling was used to characterize the antipyretic and anti-inflammatory effects in rats of Rhein， a major component in rhubarb. Twenty-four healthy male Sprague-Dawley （SD） rats were randomly into four groups， of 6 each. The rats in first group were injected intravenously with lipopolysaccharide （LPS， 100 μg·kg-1）. The second group rats were given rhubarb decoction （RD， 1.54 g·kg-1） by oral administration alone. The rats belonging to third group were administered orally RD 30min after LPS injection. The rest rats were given normal saline only as control group. Orbital sinus blood sampling was collected at different time points. The Rhein and NO concentration in plasma and body temperature （BT） were measured. Relevant data of PK-PD modeling were performed with Kinetica 5.0.11. RD could suppress the rise in BT and plasma NO concentration. The antipyretic and anti-inflammatory responses were best described by a Sigmod-Emax model. Delay between exposure and response was accounted for by a transit compartment model with two parallel transit compartment chains. The results showed that some parameters such as t1/2，Cmax and AUC were significantly increased in rats treated with LPS， compared to those in rats treated with normal saline. The EC50 for antipyretic effect and decrease of plasma NO concentration was respectively equal to 114.1， 90.80 μg·L-1. The Emax for antipyretic effect was about 111% of that for increase in BT after LPS injection. The Emax for anti-inflammatory action was close to 8.399% of that for elevated NO level after modeling. Meanwhile， there was a difference in pharmacokinetic process of Rhein between the impact of normal saline and LPS. So， it can be concluded that the targets of regulating NO production and BT after RD administration may be at the same location. Not only do that， the antipyretic effect induced by RD maybe completely manifest through reducing the plasma concentration of NO.

[Key words] rhein； nitric oxide； temperature； pharmacokinetic-pharmacodynamic binding model

doi：10.4268/cjcmm20130822

[责任编辑 陈玲]