局部应用血管内皮细胞生长因子对大鼠缺血皮瓣存活能力的影响:内皮细胞生长因子
时间：2019-02-06 04:41:00 来源：达达文档网 本文已影响 人 
【摘要】 目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)对大鼠缺血皮瓣存活能力的影响。探讨其作用机制和局部更有效的给药途径。方法 将45只SD大鼠，随机分为A、B、C三组,每组15只。于背部作6 cm×1.5 cm蒂位于双侧髂棘连线上的全层缺血皮瓣。A组在皮瓣下注射生理盐水，B组皮瓣下注射VEGF生理盐水溶液,C组皮瓣下放置含VEGF生理盐水溶液明胶海绵,原位缝合皮瓣。术后第3，7，14 d观察缺血皮瓣的成活面积,并进行组织学观察，用RT�PCR方法检测皮瓣中VEGFmRNA 的含量。结果 14天时，C组皮瓣的成活面积率明显高于B组(P+.1 文献标识码：A
皮瓣的成活在修复与重建外科领域是一个很关键的问题。尤其是提高缺血皮瓣的成活能力更是研究的重点。引起皮瓣坏死的主要原因是皮瓣血流动力学的改变，动脉血供不足，静脉排流不畅，或者是二种情况同时存在。而血管内皮细胞生长因子（VEGF）通过与存在于血管内皮上的其受体特异性结合，刺激血管形成，同时在促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生方面起着十分重要的作用。本实验通过建立大鼠背部缺血皮瓣模型（蒂∶长度＝4∶1），主要通过RT�PCR方法来观察以不同方式给予外源性VEGF后，对皮瓣成活能力的影响。
材料和方法
1.材料 试验动物：选健康SD大鼠，体重250～280 g，雌雄不限、由锦州医学院实验动物中心提供。VEGF购自美国R&D Systems公司。VEGFmRNA RT�PCR试剂盒购于上海生工生物工程技术服务有限公司。
作者简介：王继红(1973-)，女，辽宁省锦州市人，主治医师，医学硕士。
2.造模 将45只大鼠随机分为A、B、C三组，每组15只。腹腔内注射氯胺酮100 mg/kg麻醉，无菌条件下，于背部作6 cm×1.5 cm［1］蒂部位于双侧髂棘连线上的全层皮瓣，皮瓣内包括背部肉膜层,在背部肌膜的浅面进行解剖。用无菌生理盐水将VEGF配成10 ng/100 μl的工作液。术中皮瓣形成后，各组分别给予下述处理：①A组：于皮瓣双侧缘的2 cm、4 cm处, 及最远端中心点的供区及受区5对共10个位点，每位点皮下注射100 μl生理盐水，每瓣共1 ml。②B组：同A组的10个位点每一位点注射VEGF工作液100 μl,每瓣共1 ml,含VEGF100 ng。③C组：将6 cm×1.5 cm明胶海绵先敷于创面上，待其湿润后同A组的5对位点将100 ng 的VEGF溶液注入到明胶海绵上。 用1号丝线间断原位缝合皮瓣。
3.检测指标 ①外科观察：观察愈合过程中皮瓣的颜色、质地、组织水肿、坏死、炎症情况。术后每日定时观察并记录。②瓣成活率检测：于术后3天、7天和14天，用硫酸纸准确描绘各组皮瓣的形态,坏死区域用墨汁涂黑，数码照相，用图象分析软件PHOTO SHOP予以分析。皮瓣成活率=(原始皮瓣面积－坏死皮瓣面积)/原始皮瓣面积×100%。③组织学观察：分别于第3 d、7 d、14 d，每组处死5只动物。取皮瓣中远段(5 cm)处0.5 cm×1.0 cm组织块，置40 g/L中性福尔马林溶液中固定后，石蜡定向包埋,连续切片，片厚5 μm，行HE染色后用普通光镜观察。
4.VEGFmRNA的检测 分别于术后3、7、14 d，切取三组大鼠相同部位的有活力的皮瓣组织，取材后快速放入液氮中冷冻。组织彻底冻透后放入-90℃冰箱里保存。 RT�PCR的检测步骤为：①总RNA提取；②按逆转录试剂盒说明操作进行逆转录反应；③PCR扩增。PCR反应参数：94℃预变性4 min。然后，94℃ 50 s、53℃ 50 s、72℃ 50 s，共35个循环，最后延伸7 min，得到反应产物。VEGF正义引物序列为：5’�TGC ACC CAC GAC AGA AGG GGA�3’,反义引物序列为5’�TCA CCG CCT TGG CTT GTC ACA T�3’，扩增产物的片段为：VEGF121-360 bp,β�actin正义引物序列为：5’�GGT GGG TAT GGG TCA GAA�3’；反义引物序列为5’�TGC ATC CTG TCA GCG ATG�3’,扩增产物的片段为801 bp。引物由上海生工生物技术工程有限公司合成。取10 μl PCR产物上样，20 g/L琼脂糖凝胶电泳。扫描电泳照片,用凝胶成像系统测定PCR产物条带灰度值，以VEGF与相应内参β�actin基因条带灰度的比值作为结果进行分析。
5.统计学处理 采用SPSS11.5软件在计算机上进行数据处理，计量数据用-�±s表示，样本间的比较采用方差分析，P0.05）。且于7天时C组的VEGFmRNA表达为高峰期。见表2和图1。
讨论
皮瓣移植的创面愈合大致可分为三个阶段：①炎症反应，溶解、清除坏死组织和渗出物。②结缔组织细胞和血管内皮细胞游动、增殖、形成肉芽组织。③新生结缔组织基质沉积和新生组织改建。三个阶段相辅相成，互相联系，每一阶段均受到机体的精细调节，还有赖于多种化学介质的调控。血管内皮细胞生长因子与含激酶插入区血管内皮生长因子受体（VEGFR）结合后，在炎症早期经丝裂素活化蛋白激酶(MAPKs)，MAPKs亚通路中细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)激活后磷酸化,调节各种氧依赖型血管内皮生长因子(VEGF)，通过微血管形成的作用，造成氧转运和养料运输的改变，影响修复。在增殖阶段，细胞依赖Toll样受体能够激活NF�κB，该受体信号的转导引起其诱导内皮细胞分裂增殖、胶原合成等过程［2］。同时上调尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂和组织型纤维蛋白溶酶原激活剂的表达，导致血管基底膜的降解；还可以增加血管通透性，使血浆蛋白外渗，形成血管生成的临时基质。这些作用都有利于血管新生。VEGF作为内皮细胞特异的强效有丝分裂原，对缺血皮瓣一方面体现在直接作用于血管内皮细胞，促其增殖分化，促进皮瓣的毛细血管新生，提高再生血管的数量和质量，加快皮瓣与受区及皮瓣与切缘之间的血运重建，改善皮瓣远端微循环。另一方面，可减轻皮瓣缺血再灌注损伤［3，4］。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 由于血管内皮生长因子的干预,本实验中VEGFmRNA在3天时对照组与VEGF两组之间即开始出现明显差异，说明外源性VEGF可明显促进VEGFmRNA的表达，而VEGFmRN的增高，又通过一系列的信号传导引起血管内皮细胞的增殖和分裂；进而促进了肉芽组织中毛细血管的再生；因此在术后3天其皮瓣成活率的检测各组间就有显著性差异，C组和B组明显高于A组。说明在皮瓣形成早期局部由于出血，组织细胞坏死，炎性细胞反应使得血供相对减少，氧分压降低，低氧强烈诱导 VEGFmRNA的表达，加之有外源性VEGF的存在，促进了血小板、成纤维细胞及内皮细胞通过旁分泌或自分泌方式产生该细胞因子，使VEGF与其他血管生成因子共同促进血管内皮细胞增殖、分化和血管形成。在第7天时是VEGFmRNA表达的高峰期，同时也是毛细血管和成纤维细胞的快速生长期，组织切片可见C组皮片下肉芽组织含量较对照组明显增多,血管腔增大,出现血管平滑肌细胞并初步形成毛细血管网。术后14天时各组VEGFmRNA的表达量已无明显差异，说明在皮瓣修复的后期，修复趋于完成，各组间VEGFmRNA的表达也趋于平衡。本实验给予的是鼠重组VEGF165，可证明大鼠皮肤再生过程中给予外源性VEGF后可以促进内源性VEGF的旁分泌或自分泌作用，从而起到一个正反馈的作用，更加强了VEGF的局部作用，因此达到促进皮瓣再生的目的。
因为VEGF在血浆中半衰期仅30～45 min［5］。因此如何延长其作用时间，许多学者对其给药方法和途径进行了许多探讨［6~8］。本实验就是通过比较创缘供区和受区均注射VEGF和皮瓣下应用明胶海绵携带VEGF两种给药途径对皮瓣成活能力的促进作用，探讨一种更有效的给药途径。经试验证明，无论是在VEGFmRNA的基因水平上，还是在血管和成纤维细胞的组织形态上，在大体标本上，用明胶海绵作载体局部敷用VEGF比皮下注射VEGF更有效的发挥其促进缺血皮瓣的再生作用。其机制是明胶海绵作为一种可吸收的生物材料可以延长VEGF在局部的作用时间［9］，使之更持久的作用于缺血部位，促进血管内皮细胞的分裂和增殖，加快毛细血管及毛细血管网的形成从而改变局部缺血缺氧的状态，减轻再灌注造成的组织损伤，从而有效的促进缺血皮瓣的存活能力。另外明胶海绵在皮瓣下的存在起了一个支架作用，使炎症早期的炎细胞更容易黏附，从而释放出大量的细胞因子，趋化更多的炎细胞，构建起一个利于血管生成的微环境，使巨噬细胞和内皮细胞通过旁分泌和自分泌作用更多、更持久的产生内源型的VEGF，作用于缺血皮瓣的局部。并且较之目前研究较多的VEGF基因转染的方法比较起来，前者更经济，并且更容易获得，临床应用起来更方便，还避免了基因转染缺乏安全性的问题，也可避免VEGF 的非特异的全身作用。
因此，局部应用携带有VEGF的明胶海绵，对于大鼠缺血皮瓣的存活能力有明显的促进作用，其作用明显优于单纯皮下注射VEGF，并且安全无副作用，对临床治疗缺血性创面和皮瓣具有重要参考价值。
本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文
