高效液相法测定维生素Ｂ２原料药的含量:高效液相含量计算公式
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[摘要] 目的：建立HPLC法测定维生素B2的含量方法。方法：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动相为甲醇-0.35%磷酸的0.01 mol/L庚烷磺酸钠溶液(26∶74)；检测波长267 nm；流速1.0 ml/min；柱温35℃。结果：维生素B2在1.5～12 μg/ml范围内线性关系良好，回归方程为Y=94.617 65X-0.467 68（r=0.999 95，n=6），低、中、高三种浓度的回收率分别为99.48%、99.26%、100.54%，RSD分别为0.37%、0.18%、0.18%。结论：该法快速、准确，灵敏度高，重现性好，可用于维生素B2的质量控制。
[关键词] 维生素B2；高效液相色谱法；含量测定
[中图分类号] R927.2[文献标识码]Ｂ [文章编号]1673-7210（2009）01（a）-045－０3
Determination of vitamin B2 in vitamin B2 bulk drug with HPLC
TANG Hong-mei1, LUO Wen-Hua1*, CHEN Hua1 , FAN Yu- rong1,ZHANG Jin -lian2
（1.Jiangzhong Pharmaceutical Co.LTD.,Nanchang330004, China; 2. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang330004, China）
[Abstract] Objective: To establish a HPLC method for the determination of content of vitamin B2 in vitamin B2 bulk drug. Methods: The Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）was used, mobile phase was methanol-0.35%phosphoric acid and 0.01 mol/L sodium heptanesulfonate solution (26∶74) with the flow rate of 1.0 ml/min, detected wavelength was set at 267 nm, column temperature was 35℃. Results: The calibration curve was linear at the range of 1.5-12 μg/ml for vitamin B2. The linear equation was Y=94.617 65X-0.467 68(r=0.999 95, n=6), The average recovery of vitamin B2 in the low, medium and high concentrations were 99.48%, 99.26% and 100.54%, respectively; RSD were 0.37%, 0.18%, 0.18%, respectively. Conclusion: This method is rapid, accurate, high sensitivity and good reproducibility, it can be used for quality control of vitamin B2 bulk drug.
[Key words] Vitamin B2; HPLC; Determination
维生素B2，又名核黄素，为水溶性维生素，容易消化和吸收。其功效为促进发育和细胞的再生，帮助消除口腔内、唇、舌的炎症以及增进视力，减轻眼睛的疲劳等。目前维生素B2的含量测定方法主要为紫外-可见分光光度法[1]和荧光分光光度法。本文用HPLC法测定维生素B2的含量[2-4]，并与紫外-可见分光光度法进行比较，结果表明，HPLC法快速、准确、灵敏度高、重现性好。
1仪器与试药
1.1仪器
Agilent1200高效液相色谱仪（四元泵、柱温箱、VWD检测器、Agilent1200工作站）；AG245电子分析天平；UV-2450型紫外-可见分光光度仪。
1.2试药
维生素B2对照品（中国生物制品检定所，批号：0718-200004）；维生素B2原料药（北京蓝健兴达工贸有限公司提供）；甲醇为色谱醇（美国Merck公司）；水为超纯水，其他试剂为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流动相为甲醇－0.35%磷酸的0.01 mol/L庚烷磺酸钠溶液(26∶74)；检测波长267 nm；流速1.0 ml/min；柱温35℃；进样量为20 μl，理论塔板数按维生素B2峰计算，不得少于3 000。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备精密量取维生素B2对照品15 mg，置于100 ml棕色容量瓶中，加水适量，水浴加热使完全溶解，放冷，加水至刻度，摇匀，即得标准贮备溶液；精密量取标准贮备溶液2 ml置50 ml棕色容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得标准对照品溶液。
2.2.2样品溶液的制备精密量取维生素B2原料药15 mg，置于100 ml棕色容量瓶中，加水适量，水浴加热使完全溶解，放冷，加水至刻度，摇匀；精密量取2 ml置50 ml棕色容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。
2.2.3阴性样品的制备在不加入维生素B2原料药的条件下，按样品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。
2.3系统适应性试验
上述色谱条件下，分别精密量取对照溶液、样品溶液和阴性溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。分析色谱图可知：对照品、样品中维生素B2的保留时间基本一致，阴性样品在维生素B2峰位置处无色谱峰出现。色谱图见图1。
2.4线性关系考察
精密量取“2.2.1”项下标准贮备溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 ml，
分别置于50 ml棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。精密量取上述两种溶液各20 μl，按上述色谱条件分析，测定峰面积，结果见表1，图1。
以维生素B2峰面积Y为纵坐标，溶液浓度X（μg/ml）为横坐标进行绘制标准曲线，计算得回归方程为：Y=94.617 65X-0.467 68（r=0.999 95，n=6）。结果表明，维生素B2浓度在1.5～12 μg/ml范围内，具有良好线性关系。
2.5精密度试验
精密吸取维生素B2对照品溶液20 μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定峰面积，维生素B2峰面积的RSD为0.08%（n=6），表明仪器精密度良好，见表2。
2.6重复性试验
取维生素B2（批号0706001）原料，照“2.2.2”项下方法制备6份样品溶液，分别进样20 μl，测定维生素B2含量。平均含量为99.32%，RSD为0.35%（n=6）。
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2.7稳定性试验
取样品溶液，按本文色谱条件，分别于0、2、4、6、8 h进样20 μl测定，维生素B2峰面积的RSD为0.14%。结果表明，在避光条件下，维生素B2在8 h内稳定。
2.8回收率试验
精密称取已知含量（99.3%）的维生素B2原料15 mg，置于100 ml棕色容量瓶中，加水适量，水浴加热使完全溶解，放冷，加水至刻度，摇匀；精密量取2 ml置100 ml棕色容量瓶中，共9份，分别精密加入维生素B2标准贮备溶液1.2 ml、2 ml、2.8 ml，每个浓度平行3份，按本文色谱条件测定维生素B2含量，低、中、高3种浓度的回收率和RSD分别为：99.5%、99.3%、100.5%和0.37%、0.18%、0.18%，结果表明本方法准确可靠。
表5 加样回收率试验结果
2.9样品测定
按上述色谱条件分别对2个批号的样品溶液进行检测，并与药典方法测定的结果进行比较，结果见表6。
表6 维生素B2含量测定结果（n=3）
3讨论
3.1检测波长的选择
2005年版《中国药典》中维生素B2的含量测定方法为紫外法，检测波长为444 nm，查阅的资料中HPLC法的检测波长各不相同，故在200～450 nm的波长范围内进行紫外扫描，结果维生素B2在267 nm、375 nm与444 nm的波长处均有吸收，最后确定最大吸收波长267 nm为本法的检测波长。
３.2流动相的选择
查阅资料中的流动相为甲醇-0.19%磷酸的0.01 mol/L庚烷磺酸钠溶液(26∶74)。试验得知，以此为流动相，采用HPLC法测定维生素B2的含量时拖尾较严重，经过多次试验，决定用甲醇-0.35%磷酸的0.01 mol/L庚烷磺酸钠溶液(26∶74)为本法流动相。
[参考文献]
[1]国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京:化学工业出版社,2005.665.
[2]Wang Yuzhu(王玉柱), Hu Nan(胡南), Liu Qizhi(刘奇志). Study on the Vitamin contentin different flesh color Vari- eties of Apricot（若干杏品种果肉色泽与维生素含量的测定）[J]. Journal of Fruit Science（果树科学）,1999,16(1):16-20．
[3]Song Jinfeng(宋劲峰), Mo Luqiang(莫履强), Tang Guoliao(谭国燎)．Content determination of three vitamins in Miyalisangaier Granules A with Ion-RP-HPLC(离子对HPLC法测定米雅利桑爱儿A颗粒中3种维生素)[J]． Academic Journal of Guangong College of Pharmacy(广东药学院学报),1998,14(3):191-192.
[4]Liu Xiaolin(刘晓琳) ,Wu Gu(武谷), Zhong Huabin(钟淮滨)．Content determination of vitamin B1, B2, B6 and nicotinamide in compound vitamin B Liquid with HPLC (HPLC法测定复合维生素B溶液中维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺的含量)[J].Chinese Pharmaceutical Affairs (中国药事),2003,17(4):241-242.
（收稿日期：2008-08-29）
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