心可舒片对血管内皮细胞凋亡及凋亡调控基因的影响_foxo1 内皮细胞凋亡

　　摘 要：目的：探讨血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）在不同浓度和不同作用时间下对内皮细胞凋亡率及凋亡调控基因的作用及心可舒片对其影响。方法：采用流式细胞技术测定了在血管紧张素Ⅱ不同浓度和不同作用时间下内皮细胞凋亡率及凋亡基因Fas和Bcl-2表达量的变化和应用药物后对其的影响。结果：血管紧张素Ⅱ可明显促进凋亡率及凋亡基因的表达量，且其作用呈剂量依赖性和时间依赖性；经药物处理后的内皮细胞对AngⅡ的反应完全不同，凋亡率明显降低，同时Fas的表达量随药物浓度增加和作用时间延长而降低，Bcl-2则增高。结论：血管紧张素II具有明显的促进细胞凋亡和凋亡基因表达的作用；心可舒片对细胞凋亡和凋亡基因表达有一定的调节作用。
　　
　　关键词：血管紧张素II；血管内皮细胞；凋亡率； 凋亡调控基因；心可舒片
　　中图分类号：R285.5
　　文献标识码：A文章编号：
　　1673-7717（2008）05-
　　0976-03
　　
　　Effects of Xin�ke�shu Tablet on Apoptosis and Apoptosis Genes in Vascular Endothelial Cells
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　　LIANG Xu�guo�1，TIAN Zhuo�2�
　　（ 1.Yantai Yuhuangding College Affiliated Medical Hospital of Qingdao University,Yantai 264000,Shandong,China;�
　　2.Yantai Municipal Hospital of TCM,Yantai 264000,Shandong,China）�
　　Abstract：Objective：To study the effects of angiotensin II (AngII) in different concentrations and different action time on the ratio of apoptosis and expression of apoptosis genes in vascular endothelial cells and the influences of Xin�ke�shu tabelet on it.Methods ：Flow cytometer was used to measure the apoptosis rate and the expression of apoptosis genes (Fas and Bcl-2) induced by AngII in different concentrations and different action time, and influenced by the drug.Results： The apoptosis rate and the expression of apoptosis genes were induced and increased by AngII with the increase of concentrations and action time compared with the control. The expression of Fas was decreased and Bcl-2, increased with the increase of the concentrations and action time of AngII after the uses of drugs compared with AngII group. Conclusion： The apoptosis rate and the expression of apoptosis genes may be induced and increased by angiotensin II with the increase of the concentrations and the action time. The use of drug may have the regulating effect on the apoptosis rate and the expression of apoptosis genes in vascular endothelial cells.
　　
　　Keywords：Angiotensin II； vascular endothelial cell； apoptosis and apoptosis gene； Xin�ke�shu tabelet
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　　心可舒片是以丹参、葛根、三七、木香、山楂等组成的中药复合制剂。临床研究表明，心可舒片可促进心肌缺血和再灌注损伤心功能的恢复，降低冠脉阻力，减少心肌耗氧量，改善心肌对缺血性损伤的耐受力，改善心肌缺血，缓解心绞痛[1-2]。为进一步了解心可舒片与内皮细胞凋亡及凋亡调控基因之间的关系，笔者利用体外细胞培养技术，观察了在AngII作用下血管内皮细胞凋亡和凋亡基因的变化以及应用心可舒片后凋亡及凋亡调控基因的变化规律，现总结如下。�
　　
　　1材料和方法�
　　
　　1．1药品 试剂和基本仪器设备
　　血管紧张素II（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）由美国Sigma公司提供。心可舒片原粉由山东沃华医药科技股份有限公司惠赠。二氧化碳孵箱，美国Shelton公司生产。净化工作台，苏州净化设备厂生产。FACScan型流式细胞仪，美国BD公司生产。�
　　1．2心可舒片含药血清的制备
　　选择健康雄性Wistar大鼠15只，笼养3天后，按6.4g/kg心可舒片生药材，每日灌胃2次，连续7天，于末次给药后2～3h，股动脉放血，无菌分离血清，经56℃、30min灭活后，-70℃保存备用。�
　　1．3血管内皮细胞培养及处理
　　内皮细胞（细胞株ECV304，由山东省医科院基础医学研究所提供）培养按常规细胞培养方法进行，细胞培养用液组成为：DMEM培养基1g，HEPES 3.576g，NaHCO�30.37g，青、链霉素各1000U，小牛血清10mL，定容至100mL。实验采用4～6代细胞，待生长融合后，用2.5g/L胰蛋白酶消化，以（2～3）×105/孔接种于24孔培养板，孵育48h至亚融合状态，将细胞分组。�
　　1．3．1不同浓度AngII对凋亡及凋亡基因表达的影响及药物的干预作用 （1）对照组（control）：不加特殊试剂；（2）A组（AngII）：培养液中加入AngII使之终浓度分别为10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L。孵育18h后，终止反应，收集细胞，进行流式细胞仪检测；（3）B组（5%含药血清组）：培养板中加入含药血清，终浓度为5%。孵育30min后再加入AngII，使其不同孔的终浓度分别为10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L，处理同（2）组。（4）C组（10%含药血清组）：培养板中加入含药血清，终浓度为10%。孵育30min后再加入AngII，使其不同孔的终浓度分别为10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L，处理同（2）组。�
　　1．3．2不同时间AngII对凋亡及凋亡基因表达的影响及药物的干预作用 （1）对照组（control）：不加特殊试剂；（2）A组（AngII）：培养液中加入终浓度为10-6mol/L的AngII，分别在加入药物后的0.5、2、6、18、24h终止反应，收集细胞，进行流式细胞仪检测；（3）B组（5%含药血清组）：培养板中加入含药血清，终浓度为5%。孵育30min后加入终浓度为10-6mol/L的AngII，分别在上述不同时间终止反应，同（2）组。（4）C组（10%含药血清组）：培养板中加入含药血清，终浓度为10%。孵育30min后加入终浓度为10-6mol/L的AngII，分别在上述不同时间终止反应，同（2）组。�
　　1．4流式细胞仪检测
　　细胞消化收集后，将其吹打成单细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清，用PBS漂洗，再离心，再漂洗后以100目筛网过滤，然后再离心（1500r/min，5min），加入碘化丙啶（promide iodine，PI）工作液0.5mL，终浓度为10mg/L，室温避光30min后上机进行流式细胞仪检测。
　　上机前以标准荧光微球调整仪器的变异系数并稳定在2%以内，上机后收集2万个细胞，荧光强度以对数放大，光散射数据存软盘，测试完后在Macintosh 650计算机上用CellQuest Plot软件（BD公司提供）分析数据，由HP1200c/PS打印结果。
　　内皮细胞凋亡基因表达量以标记阳性细胞百分率表示：
　　凋亡基因表达量=标记阳性细胞数/受检细胞数×100%-非特异结合细胞%。�
　　1．5统计学处理
　　各项数据以均数±标准差（±s）表示。计量资料分析采用方差分析，两两比较采用q检验或t 检验，计数资料分析采用卡方检验，显著性水平为P-8mol/L浓度时，凋亡率就明显增加，10-7mol/L浓度时与对照组相比，差异显著；浓度增加至10-6mol/L及以上时差异极其显著。用药组凋亡率较AngII组明显降低，10%浓度C组在10-5mol/L刺激浓度下，与AngII组相比，有显著差异。（见表1）。同时内皮细胞在AngII作用下，随作用时间不同发生一定的变化。在本实验条件下，10-6mol/L的AngII作用0.5h，凋亡率即明显增加，且呈时间依赖性，18h左右达高峰。用药组（C组）在2h和18h时凋亡率明显降低，与AngII组相比，有显著差异（见表2）。
　　
　　2.2 不同AngII浓度及不同作用时间下凋亡基因表达的变化及药物对其影响
　　在AngII的作用下，凋亡调控基因的表达也发生了明显的变化。随着AngII浓度的增加，各基因的表达量也显著增加，与对照组相比差异极其显著。应用药物后Fas表达呈现降低趋势，在10-6、10-5mol/L浓度时降低明显，与A组相比，差异显著；Bcl-2则有所增加，与A组相比，C组的10-5mol/L浓度差异显著（见表3）。同时，在10-6mol/L AngII作用下，随作用时间的延长，调控基因的表达均增加，18h左右达到高峰，与对照组相比，差异极其显著。经药物处理后，Fas表达呈现下降趋势，C组6h与A组相比，差异显著；Bcl-2有所增加，C组6h及24h与A组相比，均差异显著（见表4）。
　　
　　
　　3 讨 论
　　
　　冠心病是慢性非传染性疾病的主要死因，严重危害人类健康。2006年美国《循环》杂志最新数据显示冠心病占心血管病总死亡率的53%[3]。因此，冠性病的防治是目前摆在医务工作者面前的主要工作之一。
　　血管内皮细胞通过代谢、生成、激活、释放多种血管活性物质影响血管紧张度，对抗炎性细胞黏附和血栓形成，维持抗栓和促凝活性平衡。各种病理条件引起的内皮功能失调，对于动脉粥样硬化、冠心病的发生发展起着重要作用。
　　本研究中，血管内皮细胞在AngII作用下，凋亡率及Fas及Bcl-2的表达量发生了明显的变化。随着AngII浓度的增加和作用时间的延长，表达量均显著增加。经药物处理后的内皮细胞凋亡率和凋亡基因表达发生了明显的变化，Fas的表达量随药物浓度增加和作用时间延长而降低，Bcl-2则增高。该结果表明，内皮细胞凋亡基因表达与AngII作用有极密切关系。现已知Fas和Bcl-2对凋亡的作用和影响是相反的[4]，但在AngII的作用下，与对照组相比，二者均显著增加，其机理尚不十分明确。AngII主要通过其I型受体（AT1）进行介导内皮细胞凋亡[5]，抑制内皮细胞移行[6]及提高内皮细胞组织因子表达[7]。本实验室在血管内皮细胞、平滑肌细胞及临床研究中也发现细胞凋亡与Fas和Bcl-2的表达有关，并与ACEI和ARB的作用有密切关系[8-11]。
　　细胞凋亡是生物界重要的生命现象之一，生物体内环境的稳定，不但依赖细胞增殖和分化，也依赖于细胞的凋亡[12]。本研究显示，心可舒片含药血清预处理的内皮细胞可明显对抗AngII导致的凋亡作用并对凋亡基因Fas和Bcl-2的表达有一定的作用。其作用机理尚有待进一步研究，但是可为心可舒片防治动脉粥样硬化、冠心病提供一定的理论基础。�
　　
　　参考文献�
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