盐酸米诺环素脂质体控释凝胶改善大鼠实验性牙周炎的作用评价

刘迪　杨丕山　胡德渝等

[摘要] 目的 在动物体内检验盐酸米诺环素脂质体控释凝胶的生物相容性及其对牙周炎动物模型的修复效果。方法 毒性实验：用质量分数2%盐酸米诺环素脂质体控释凝胶溶液给SD大鼠灌胃，观察长期应用该制剂有无全身不良反应及其反应程度。牙周炎动物模型实验：将实验性牙周炎建模成功的SD大鼠分为3 组，A组为派丽奥组，B组为实验药物组，C组为阴性对照组；
A、B组每周牙周袋内给药1次，连续56 d，C组给予生理盐水；
分别在给药7、14、28、56 d后测量各组动物的牙周探诊深度（PD）和牙龈指数（GI），并进行组织学观察，计算单核细胞和破骨细胞的数目。结果 盐酸米诺环素脂质体控释凝胶具有良好的生物相容性；
给药14 d后，PD、GI，以及单核细胞和破骨细胞数目均较其他两组明显降低，组织学观察可见新骨及部分新纤维形成。结论 牙周袋内使用盐酸米诺环素脂质体控释凝胶可减轻牙周炎症，提示该制剂对改善牙周炎有一定的疗效，具有临床应用前景。

[关键词] 脂质体；

盐酸米诺环素；

实验性牙周炎；

动物模型

[中图分类号] R 781.4 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.06.012

四环素族药物是治疗牙周病的代表药物。治疗牙周病时，如果采用全身用药，具有给药剂量大，易产生耐药性等缺点，且局部疗效并不令人满意；
随着小剂量四环素类药物具有调节宿主免疫反应这一新的作用机制的发现，各国学者都在积极探索新的给药方法或进行新剂型的开发，已经取得了较大的进展。

四环素类药物局部给药的重要进展是控、缓释剂型的应用，如四环素纤维棒、多西环素凝胶、米诺环素微球等。这种剂型的优点是置入牙周袋内后，药物能缓慢持久地释放，从而达到持续抗菌和有效改善牙周组织的作用，且某些缓释材料可被局部组织吸收，使用方便；
可减少给药次数，平均每周给药1次，提高患者的依从性[1]。任蕾等[2]的研究显示，米诺环素对牙周主要致病菌的抑菌效果较好，其抗菌谱较其他药物更为理想，可作为牙周炎急性发作时的首选药物。

脂质体作为一种药物载体，其组成和结构与细胞膜十分相似，渗透力强，能穿透上皮屏障，对网织内皮系统具有趋向性，易被吞噬细胞摄取而实现细胞内给药，提高了药物的生物利用度，减少了给药剂量，可以减轻甚至避免药物的不良反应[3]。本研究通过动物实验检验一种新型盐酸米诺环素脂质体控释凝胶的生物相容性及其对动物牙周损伤模型修复的效果，为其在牙周病治疗中的应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验设备和材料

无龋坏及牙周病的5周龄SD大鼠（四川大学华西动物实验中心）；
牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277（四川大学口腔疾病研究国家重点实验室）；
质量分数2%（每克含20 mg盐酸米诺环素脂质体）盐酸米诺环素脂质体控释凝胶（四川大学华西药学院药剂学实验室）；
2%（每克含20 mg盐酸米诺环素）盐酸米诺环素软膏派丽奥。

1.2 盐酸米诺环素脂质体控释凝胶对大鼠的全身毒

性实验

健康SD大鼠20只，实验组和对照组各10只，雌雄各半。实验组：2%盐酸米诺环素脂质体控释凝胶用双蒸水配制成2%样品水溶液；
对照组：双蒸水；
以每天5 mL·kg-1的剂量连续灌胃，30 d后观察2组大鼠的体重变化及临床毒性体征。将灌胃大鼠的肝脏、肾脏组织取出，观察组织病理学变化，评价其组织相容性。

1.3 盐酸米诺环素脂质体控释凝胶对大鼠实验性牙

周炎的影响

1.3.1 大鼠实验性牙周炎模型的建立 选择雌性SD大鼠建立牙周炎动物模型。以10%水合氯醛溶液行腹腔注射麻醉，然后用直径0.2 mm正畸钢丝在左上颌第一磨牙靠近牙龈根方做牙颈部结扎1周，在腭侧近中打结，结扎后在龈沟内接种牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277，配10%葡萄糖水喂食[4]。建模后21 d测量牙周探诊深度（probing depth，PD）、牙龈指数（gingival index，GI），制作左上颌第一磨牙及牙周组织切片，通过苏木精-伊红（hematine-eosin，HE）染色法处理后，光学显微镜下观察牙周组织的病理学变化。

1.3.2 实验分组及检测方法 建模成功的78只大鼠，体重（172.5±10.2）g，将其中的72只大鼠（另外6只因操作不当不适于进行下一步实验而被排除）按GI、PD值均衡分成3组，给予不同的药物治疗：A组为阳性对照组，使用派丽奥；
B组为实验组，使用2%盐酸米诺环素脂质体控释凝胶；
C组为阴性对照组，使用0.9%生理盐水。每组有24只大鼠，分别观察7、14、28、56 d，每个时间段每组检查6只大鼠，检测牙位为左上颌第一磨牙。每组每周牙周袋内给药1次，用药前用探针机械清理牙面，将药物注入牙周袋内。分别在给药7、14、28、56 d后测量每只动物左上颌第一磨牙的PD和GI，每组分别处死6只动物进行单核细胞和破骨细胞计数，并行组织学观察。

2 结果

2.1 盐酸米诺环素脂质体控释凝胶的全身毒性

连续灌胃30 d后，对照组和实验组的体重相对增长率分别为27%和29%，2组的差异无统计学意义（P>0.05）。实验组大鼠的肝脏、肾脏组织切片正常，未发现结构破坏和毒性物质沉积，提示该药物在机体内无毒性作用。

2.2 建模效果评价

建模21 d，分别观察78只大鼠左上颌第一磨牙，共计78颗牙。肉眼观察可见：牙龈红肿，第一、二磨牙间牙龈乳头红肿。GI分级平均为3，探及牙周袋；
PD均值为1.59 mm。处死6只大鼠，观察牙周组织的病理学变化，结果见图 1：牙龈组织有大量单核细胞浸润，结合上皮根向增殖，形成牙周袋；
牙周袋内上皮糜烂，可见细菌团块；
牙周纤维有大量炎症细胞浸润，细胞变性水肿，纤维排列紊乱，甚至断裂；
有较多破骨细胞及吸收陷窝，牙槽嵴顶有明显吸收。

2.3 GI和PD测量结果

不同观察时间3组大鼠左上颌第一磨牙GI和PD的测量结果见表1。给药7 d时，A、B组大鼠左上颌第一磨牙的GI与基线相比较均降低，B组较A组更为明显；
A、B组的PD与基线相比，其差异无统计学意义（P>0.05）。给药14 d时，与C组比较，A、B组的GI均有明显降低；
A组和C组PD的差异无统计学意义，而B组的PD明显低于A、C组（P<0.05）。给药28 d和56 d时，A、B组的GI、PD均有明显降低，2组PD均明显低于C组（P<0.05），其中B组的PD降低更明显，与A组比较其差异亦有统计学意义（P<0.05）。

2.4 组织学观察结果

2.4.1 单核细胞和破骨细胞计数结果 选择包埋较好的3个蜡块，每个蜡块选取1张包含3个磨牙在内的组织切片，在显微镜下连续摄取4张矩形数码照片，手工选出单核细胞及破骨细胞并计数，其结果见表2。给药7 d时，A、B组单核细胞和破骨细胞数目与C组相比，差异无统计学意义（P>0.05），A、B组间也无明显差别（P>0.05）。给药14、28、56 d时，A、B组单核细胞和破骨细胞数量均明显低于C组（P<

0.05），B组单核细胞和破骨细胞数量减少得更明显，与A组比较也有统计学差异（P<0.05）。

2.4.2 组织学观察结果 3组牙齿的组织学观察结果见图2。给药7 d时，A、B组牙周纤维可见炎症细胞浸润，有少量破骨细胞，牙槽骨未见明显吸收；
C组有大量炎症细胞浸润，破骨细胞活跃。给药14、28 d时，A组结合上皮的位置向冠方移动，未见新纤维形成；
B组结合上皮的位置向冠方移动，可见少量新纤维生成，未见新骨形成；
C组结合上皮内有大量炎症细胞浸润，继续向根方增殖，牙槽嵴顶吸收至根尖1/3。给药56 d时，A组可见新纤维形成，未见明显的新骨形成；
B组可见大量新纤维形成，并有新生牙槽骨组织形成；
C组牙周纤维排列紊乱、有断裂，牙槽嵴顶继续向根方吸收。

3 讨论

牙周疾病是危害人类牙齿和全身健康的主要口腔疾病。四环素类药物能够调节宿主免疫反应，有效改善各项牙周指数，提高牙周炎治疗的成功率。应用脂质体作为药物载体，可使药物更具渗透力，实现细胞内给药，提高药物的生物利用度。

采用本课题组研制的盐酸米诺环素脂质体控释凝胶新制剂水溶液给SD大鼠灌胃，发现该制剂对大鼠体重的增长无明显影响，肝脏、肾脏组织切片正常，未发现组织细胞结构破坏和毒性物质沉积，提示该制剂在机体内无长期毒性作用，具有较好的组织相容性和安全性，初步显示了良好的应用前景。为了进一步验证盐酸米诺环素脂质体控释凝胶临床应用的可行性，本实验建立了SD 大鼠牙周炎动物模型进行研究。牙龈的炎症和牙周袋形成是牙周炎最重要的病理改变。GI可以反映牙龈炎症的程度，而PD是牙周病最重要的检查方法，本实验中采用GI和PD以及组织学观察共同评价药物的作用效果。盐酸米诺环素可通过与胶原酶活化所必须的金属阳离子Ca2+、Zn2+螯合来抑制中性粒细胞，并可诱导成熟破骨细胞的凋亡，抑制破骨细胞的生成，还可增强Ⅰ型胶原纤维的合成，稳定胶原基质为成骨细胞的分化提供重要场所，促进成骨[5-7]。通过组织病理切片观察单核细胞及破骨细胞的数量变化判定炎症转归，以及牙槽嵴改建情况是非常可靠的方法，这样得到的实验结果可信度高。

抑菌作用是盐酸米诺环素在牙周炎治疗中发挥的主要作用之一。以往的研究[8]发现，盐酸米诺环素对一系列牙周致病菌包牙龈拟杆菌、中间普雷沃菌、啮蚀艾肯菌、具核梭杆菌的90%最小抑菌浓度分别为0.1、0.39、0.39、0.78 ?g·mL-1。盐酸米诺环素脂质体控释凝胶的有效药物质量分数为2%，可充分发挥其抑菌作用。本实验中，阳性对照组选择2%盐酸米诺环素软膏派丽奥，是目前已经广泛应用于临床的缓释抗菌药物[9-10]。缓释制剂的特点是能提高牙周袋内盐酸米诺环素的浓度，但药物释放速度不恒定，通常在其置入袋内2～3 d内释放出80%～90%的盐酸米诺环素，随后释放速度变慢，药物浓度明显下降，牙周袋内药物浓度波动较大[8]。在盐酸米诺环素控释脂质体前期对巨噬细胞作用的研究[11]中发现，该药物与派丽奥比较能够匀速释放药物，恒定持续地抑制肿瘤坏死因子α的产生，发挥控释作用；
而派丽奥则通过波动性持续抑制而发挥缓释作用。本药物的控释作用可使盐酸米诺环素在预定时间内自动按某一速度从剂型中以恒定的速度释放于牙周袋内，使牙周袋内的药物浓度在较长时间内恒定地维持在有效范围内，延长有效作用时间[12]。脂质体具有控释作用主要是由于其提供了外源性双层膜，使角质层细胞间结构改变，脂质双分子层疏水性尾部排列紊乱，药物可通过扩散和毛细管作用进入细胞间隙，使角质层湿化和水合作用增强；
脂质体磷脂与角质层脂质融合后，被细胞内的溶酶体所破坏，使药物匀速释放[13]。

本研究中，给药7 d后，A、B组各项指标仅略微下降，与C组相比差异无统计学意义（P>0.05），这可能是因为大鼠牙周破坏严重，给药时间短，已破坏的牙周组织还未完全修复所致。实验期内，实验药物组（B组）牙周炎开始改善的时间早于A组，在已经观察的2个月内，实验药物显示出更好的抗炎作用，这跟两组药物剂型不同有关。脂质体由磷脂双分子层包覆水相囊泡构成，生物相容性好，对所载药物有广泛的适应性，水溶性药物载入内水相，脂溶性药物溶于脂膜内，两亲性药物可插于脂膜上[14]；
磷脂本身是细胞膜成分，注入体内无毒，生物利用度高，且不引起免疫反应；
脂质体还能保护所载的药物，防止体液对药物的稀释和被体内的酶分解破坏[15]。本研究证明，2%盐酸米诺环素脂质体控释凝胶改善大鼠实验性牙周炎的效果优于派丽奥。

本研究结果提示：盐酸米诺环素脂质体控释凝胶能够改善牙周组织病变，抑制单核细胞和破骨细胞数量的增加，改善牙龈炎症和牙周袋深度，并可促进新牙周纤维及新骨的生成；
这为该凝胶治疗牙周病提供了初步的实验依据，也证明其具有临床应用前景。

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（本文编辑 吴爱华）