【针刺对部分去背根猫脊髓背角与备用背根节神经营养素家族及其mRNA表达的影响】脊髓型颈椎病临床表现
时间：2019-01-16 04:43:30 来源：达达文档网 本文已影响 人 
[摘 要]目的：探讨针刺促脊髓背根侧枝出芽的机制。方法：用免疫组化和原位杂交技术检测部分去传入纤维并针刺后，猫脊髓Ⅱ板层和保留背根节内3种神经营养素及其mRNA的表达变化。结果：NGF及其mRNA分布于Ⅱ板层神经元内，针刺对二者的表达无显著影响。BDNF主要分布于神经终末和膨体内，NT-3主要分布于神经元和胶质细胞内，二者的mRNA均阴性，针刺组该二因子的表达均显著增强。三种因子及其mRNA在保留背根节部分神经元内表达，针刺组3种因子及其mRNA表达均显著增强。结论：针刺促进3种因子及其mRNA在保留背根节的表达，可能是其促进部分去传入纤维猫脊髓可塑性的机制之一。
[主题词] 神经营养素；脊神经根/针灸效应；神经节，脊/针灸效应；RNA，信使/针灸效应
EffectofAcupunctureonNeurotrophinFamilyandTheirmRNAExpressioninSpinalDorsalHorn
andSparedDorsalRootGanglionofCatsafterPartialRhizotomy
ZhouXue，WuLiangfang，WangTinghua，etal.(DepartmentofHistology&Embryology，
WestChinaMedicalCenter，SichuanUniversity，Chengdu610041，China)
[Abstract]PurposeToexplorethemechanismofacupuncturepromotingspinaldorsalrootfib
ercollateralsprouting.MethodsABCimmunohistochemicalandinsitushibridizationt
echniqueswereusedtoanalyzethechangesofNGF，BD-NF，
NT-3andtheirmRNAexpressioninspinallaminaⅡ
andspareddorsalrootganglion(DRG)afterrhizotomyofpar-tialdorsalrootofthecata
ndacupuncturetreatment.Results InspinallaminaⅡ，
NGFanditsmRNAweredetectedinpartofneurons，
andacupuncturedidnotinfluencetheirexpression.BDNFinnervefibersterminalsandv
aricosities，
NT-3inpartofneuronsandneuroglias.ThemRNAsofthelatertwowerenegative.Acupunct
ureincreasedtheexpressionofthetwofactors.InsparedDRG，
thethreefactorsandtheirmRNAwereexpressedinpartofneuronsandwerepromotedbyacu
puncturegreatly.Conclusion TheincreaseofexpressionofNGF，BDNF，
NT-3andtheirmRNAinsparedDRGmaybeoneofthemechanismsofacupuncturepromotingspi
nalplasticity.
[Keywords] NeurotrophinFamily�；SpinalNerveRoots/acupeff；Ganglia，
Spinal/acupeff；RNA，Messenger/acupeff
针刺对脊髓损伤有一定的治疗作用，但其作用机制不清。既往研究证实，针刺可促进部分去背根猫传入纤维的侧枝出芽，这一作用与脊髓背角内某些神经营养活性物质含量的增加有关[1]。本研究用免疫组织化学和原位杂交技术研究了在切断猫脊髓一侧或双侧大部分背根传入纤维并针刺后，神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素-3及其mRNA在脊髓背角Ⅱ板层和备用背根节内表达的变化，旨在为阐明针刺作用的机制作一些有益的探索。
1 材料和方法
1.1 动物分组、动物手术、针刺及取材
体重2.5～4.0kg的成年健康雄性家猫15只，随机分为3组，其中5只为手术组(切断一侧L1～L5、L7～S2背根，保留L6背根为备用根)，5只为手术并针刺组，5只行双侧备用根手术，一侧针刺。针刺于手术当日开始，选用L6脊神经外周支配区内的"足三里"和"悬钟"及"伏兔"和"三阴交"2组穴位，两根28号1寸毫针分别刺入一组中的2个穴位作为正负极电针，进针深度0.8～2mm，用HBEDT-Ⅱ袖珍型穴位诊治仪，频率98次/min，针刺30min、15min时交换电极。每天针刺术侧1组穴位，两组穴位交换进行。单侧备用根手术猫针刺11天后取材，用于神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)检测；双侧备用根手术猫针刺7天后取材，用于脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)和神经营养素-3(NT-3)检测。
取各组L5及L6节段中部脊髓和L6背根节(dorsalrootganglion，DRG)，入4%多聚甲醛和0.3%饱和苦味酸混合固定液后固定。恒冷箱切片，片厚20μm。
1.2 免疫组织化学与原位杂交染色
1.2.1 免疫组织化学染色用兔抗鼠NGF(1∶40000，Sigma)、BDNF(1∶500，SantaCruz)、NT-3(1∶1500，SantaCruz)抗血清，进行常规ABC(Vector)免疫组化漂片法染色，DAB呈色，用空白、置换和吸收实验验证反应的特异性。
1.2.2 原位杂交染色
切片经漂洗、消化和封闭处理后，用Dig-NGF-cRNA，Dig-BDNF-cRNA和Dig-NT-3-cRNA探针杂交，然后用AKP-抗Dig抗体标记物，最后用NBT/BCIP呈色。同步设空白、特异对照。
1.3 结果测定和统计处理
用MIAS2000图像分析仪，以Ⅱ板层的内、中、外三个恒定大小、恒定区域作为视场，测定阳性反应物的数量。背根节的阳性细胞数在光镜下直接计数。统计学处理用多个样本均数的q检验。
2 结果
2.1 NGF及其mRNA的表达变化
脊髓背角Ⅱ板层内NGF及其mRNA阳性细胞主要为神经元，NGF阳性神经元胞核的染色较胞质深，mRNA阳性神经元仅胞质染色。针刺组NGF及其mRNA阳性神经元数与手术组比较，差异无显著性意义(见表1)。手术组DRG内有许多大、中、小型NGF、NGFmRNA阳性神经元，其染色情况与脊髓同，针刺组NGF、NGFmRNA阳性神经元数明显高于手术组(见表1)。
2.2 BDNF及其mRNA的表达变化
脊髓背角Ⅱ板层内遍布BDNF的阳性反应颗粒样结构，主要是神经纤维终末和膨体的断面，BD-NFmRNA阴性。针刺组BDNF阳性膨体密度较手术组显著增加(见表2)。L6DRG内BDNF，BDNFmRNA阳性的细胞主要为中、小神经元，针刺组二者的阳性细胞数较手术组显著增加(见表2)
2.3 NT-3及其mRNA的表达变化
背角内未见NT-3mRNA阳性反应。Ⅱ板层内NT-3阳性反应物分布于部分神经元、胶质细胞胞质内和少量神经纤维及膨体中，针刺组NT-3阳性神经元及胶质细胞数较手术组明显增加(见表3)。手术组L6DRG内大、中、小神经元均有部分呈NT-3及NT-3mRNA阳性反应，针刺后阳性大、小神经元的数量明显增加，而中等大小神经元数无明显改变(见表3)。
3 讨论
针刺对脊髓损伤的恢复有明显的治疗作用，总表有效率高达90%以上[2，3]。形态学方面的研究发现，电针刺激不仅使脊髓中神经纤维终末的面积增大[4]，而且通过促进完好神经纤维侧枝出芽而使突触终末数量得以明显恢复[5]。但针刺的机理如何，尚处于探索之中。有报道认为，针刺可在穴位间产生电场，从而促进神经纤维的再生[6]；还有人发现，针刺可改变体内睾酮、吗啡类物质的含量，这些物质对神经纤维的再生有一定的功效[7]；近期研究显示，针刺可诱导c-fos、c-jun两种原癌基因的表达和蛋白的合成，这些蛋白作为细胞核的第3信使，可启动和调控某些具有特殊功能意义的靶基因(如NGF基因)的表达，进而对神经元的生长、分化和神经纤维再生起重要作用[8]。
本室既往研究发现，切断猫一侧大部分背根后针刺保留备用根支配范围内的穴位，脊髓背角内某些神经营养物质的表达增加，这可能是针刺促进备用根纤维侧枝出芽的原因之一[1]。本研究用原位杂交和免疫组化技术检测了备用根手术并针刺后，猫脊髓背角及备用背根节内神经营养素家族的3个成员---NGF、BDNF和NT-3在核酸、蛋白水平表达的变化情况。结果显示脊髓Ⅱ板层内有NGF及其mRNA阳性神经元，表明这些细胞自身有合成NGF的能力。针刺后二者在脊髓的表达未受影响，而在备用背根节内的表达却显著增强。本研究观察到猫脊髓背角Ⅱ板层内BDNF免疫反应阳性产物主要分布于神经终末前膨体和少量神经元内，未见BDNFmRNA阳性反应，提示该处的BDNF可能主要来源于其他区域。由于背根节小神经元发出的无髓和薄髓纤维主要投射到脊髓Ⅰ、Ⅱ板层，而本研究也观察到背根节小神经元表达BDNF及其mRNA，另有研究证实背角神经元有BDNF受体trkB及其mRNA表达[9]。故笔者认为，背角内的BDNF可能主要由背根节小神经元合成后经其中枢支运输而来。针刺后Ⅱ板层内BDNF阳性膨体的增加，正是针刺促进了背根节神经元BDNF核酸和蛋白的表达所致。NT-3及其mRNA的情况与BDNF相似。
由上可见，针刺信号可能经外周支传递到备用背根节，使其神经元表达NGF，BDNF和NT-3的能力增强，为备用根纤维在脊髓内的侧枝出芽和突触重建创造了一个良好的微环境，从而实现针刺对脊髓损伤修复的治疗作用。
4 参考文献
1 张新胜，周雪，吴良芳，等.电针刺激对脊髓背角组织中神经营养活性物质的影响.华西医科大学学报，1998；29(3)：264
2 刘杰.针刺为主综合治疗外伤性截瘫38例临床观察.针灸临床杂志，1994；10(3)：16
3 徐斌.脊髓针刺为主的综合治疗外伤性截瘫286例疗效观察.中国针灸，1990；10(2)：7
4 斋藤基一郎.电针刺激猫"中理"的脊髓突触变化的实验形态学研究.神经解剖学杂志，1989；5(2)：157
5 董红心，吴良芳，保天然.针刺对猫脊髓Ⅱ板层突触性终末可塑性的影响---电镜定量研究.神经解剖学杂志，1994；10(1)：6
6 孙忠人，金淑英，孙远征，等.针刺对周围神经损伤再生修复的机理研究---针刺对坐骨神经损伤诱发电位的影响.中国中医药科技，1996；3(2)：10
7 陆卓珊，孙淑曼，董晓彤.针刺镇痛时脑和脊髓内脑啡肽含量的变化，中国针灸，1986；6(5)：26
8 崔霞.电针刺激下即刻早期基因和前脑啡肽基因在中枢神经系统中的表达及定位研究.生理科学进展.1995；26(3)：230
9 ZhouXF，ParadaLF，SoppetD，etal.DistributionofTrkBTyrosineKinaseImmunoreactivityintheRatCentralNervousSystem.BrainRes，1993；622(1～2)：63
(收稿日期：2001-12-28，齐淑兰发稿)
国家自然科学基金(批准号39800191)和四川省科委基金资助
