大孢粘球菌抗肿瘤活性蛋白WGF5分离方法的优化与活性分析

魏慧 黄海燕 于芳楠 刘熊 丁学知 夏立秋

摘 要 为从Myxococcus macrosporus STXZ54发酵液中高效地分离纯化出抗肿瘤活性蛋白WGF5，收集STXZ54发酵上清液，先后利用优化后的硫酸铵沉淀方法沉淀蛋白，强阳离子交换、分子筛色谱分离等方法对蛋白粗提物进行精细分离.利用CCK-8试剂盒，倒置显微镜、扫描电子显微镜等观察WGF5对肿瘤细胞形态的影响，台盼蓝染色进一步检测WGF5对肿瘤细胞的毒力.实验结果观察到WGF5能够显著改变肿瘤细胞形态，与原分离体系相比较，优化后的抗肿瘤活性蛋白分离方法更为高效，简便易行.

关键词 大孢粘球菌；
抗肿瘤活性蛋白；
方法优化

中图分类号 Q936文献标识码 A文章编号 1000-2537（2017）06-0044-05

Abstract The anti-tumor active protein WGF5 was isolated and purified from Myxococcus macrosporus STXZ54 fermentation broth by method optimization. Collected supernatant of STXZ54 and the protein WGF5 was separated by the optimized method of precipitating protein， including strong cation exchange and molecular sieve chromatography.The effect of WGF5 on the morphology of tumor cells was further examined by CCK-8 kit， inverted microscope， scanning electron microscope， and trypan blue staining.Our experimental results showed that WGF5 significantly affected tumor cell morphology， compared with the original separation system，our present optimized anti-tumor activity protein separation method is not only more efficient but also simpler.

Key words Myxococcus macrosporus；

antitumor activity， separation method optimization

粘细菌（Myxobacteria）是一类具有独特复杂细胞行为的革兰氏阴性杆状细菌，在自然界中广泛存在于土壤、腐枝枯叶，甚至极端环境中[1].粘细菌在其生命活动中可以产生具有多种生物活性的次级代谢产物和衍生物[2-5]，具有抗菌、抗肿瘤等重要功能[6-12]，成为发现新型药物前体分子的重要资源.文也等[13]先后利用40%～75%硫酸铵分级沉淀方法分离发酵上清液中的蛋白质组分，弱阳离子交换色谱分离方法、分子筛色谱方法、反相色谱分离方法相结合从大孢粘球菌STXZ54中分离纯化出了单一的蛋白类活性物质WGF5.其相对分子质量大小为20 000，在常温下性质稳定，能够高效地抑制 B16，Hela，HCT-116，4T1及Hep-3b等多种肿瘤细胞的生长，属于高效广谱的抗肿瘤蛋白类活性物质.本研究通过全面优化WGF5的纯化方法，探究出更适合蛋白粗分离的硫酸铵梯度沉淀方法，以获得更多的目的蛋白.用强阳离子交换色谱柱代替弱阳离子交换柱，同时改变分子筛色谱的柱型与分离方法，快速高效地从大孢粘球菌STXZ54中分离得到WGF5，为该物质的大量制备提供更便捷有效的方法.冷场扫描电镜、台盼蓝染色等进一步分析了WGF5对肿瘤细胞的毒力，为其研发与应用提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 Myxococcus macrosporus STXZ54，由本实验室分离纯化并鉴定的新菌株，菌种保藏号（CCTCC NO：
M2014455）.

1.1.2 供试细胞株 小鼠黑色素瘤细胞（Murine Melanoma B16 cells）.

1.1.3 培养基

（1）Wax固体培养基：CaCl2·2H2O 1 g，HEPES 0.5 g，琼脂粉15 g，水1 000 mL，pH 7.2；

（2）CTT固体培养基：酪蛋白胨 10 g，MgSO4·7H2O 8 mmol/L，磷酸钾缓冲液（pH7.6） 1 mmol/L，Tris-HCl缓冲液（pH7.6） 10 mmol/L，琼脂糖15 g，pH7.6；

（3）MD1液体培养基：酪蛋白6 g，可溶性淀粉 2 g，MgSO4·7H2O 2 g，CaCl2·2H2O 0.4 g，水1 000 mL，pH 7.2.

1.1.4 試剂与仪器 甲醇、乙腈、硫酸铵、AKTA蛋白纯化系统、酶标仪、生物安全柜、冷场扫描电子显微镜.

1.2 菌体的发酵培养

将本实验保藏的实验菌株Myxococcus macrosporus STXZ54 先接种到CTT固体培养基上培养3 d，再从平板上转接至1.5 mL EP管中30 ℃培养活化2 d后，转接到20 mL小瓶MD1液体培养基中扩大培养，按2.5%的比例接种到2 L大摇瓶中，30 ℃，160 r/min培养6 d，10 000 r/min离心20 min，收集发酵上清液.

1.3 CCK-8法检测细胞毒性

在96孔板中铺入B16细胞，103个/孔，CO2细胞培养箱，37 ℃温度环境中培养12 h.实验组加入待测样品，对照组加入等体积的PBS，持续在细胞培养箱中培养24 h.在黑暗环境下，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，CO2培养箱中继续孵育1～2 h，用酶标仪测定各孔吸光值，计算相应的细胞抑制率.

1.4 抗肿瘤活性物质分离体系的优化

1.4.1 硫酸铵沉淀蛋白方法的优化 STXZ54发酵6 d后，收集发酵上清液1 L，分成体积相等的四等分于4组大烧杯中.在第一组发酵上清液中缓慢加入硫酸铵至浓度35%；
在第二组发酵上清液中分别加入硫酸铵至35%和70%饱和度分级沉淀蛋白；
在第三组发酵上清液中分别加入硫酸铵至70%和100%饱和度；
在第四组发酵上清液中分别加入硫酸铵至40%和75%饱和度（文也等[13]所使用的硫酸铵分级沉淀浓度梯度）.12 000 r/min收集各组段沉淀的蛋白，经透析袋（MWCO 7 000～13 000）透析脱盐，13 000 r/min离心 5 min 收集上清液.过滤除菌后，对各样品的细胞毒性进行实验比较.取上清液 20 μL SDS-PAGE 检测蛋白成分.

1.4.2 高效液相色谱精细分离体系的优化

（1）强阳离子交换色谱分离 配制pH 5.0的 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（A相）和pH5.0的 0.5 mol/L的NaCl溶液（B相）.選择强阳离子色谱柱SPFF色谱柱对粗体蛋白进行AKTA蛋白纯化系统分离.用A相先进行4个柱体积的上样挂柱，B相进行色谱峰的洗脱，洗脱时，B相起始浓度为0%，在20个柱体积内浓度线性增大到100%.流速0.5 mL/min，检测波长254 nm.收集各个色谱峰，以备细胞毒性检测.

（2）分子筛色谱分离 将强阳离子交换色谱分离出的活性峰进行细胞实验后，选择有活性的色谱峰进行分子筛色谱分离.色谱柱为Sephadex 200 10/300，流动相为ddH2O，流速0.8 mL/min，检测波长：215 nm.收集每个色谱峰，冷冻浓缩后进行细胞毒性实验.

（3）SDS-PAGE检测分离活性组分的纯度 将收集到的样品冷冻浓缩后，以12%胶浓度进行SDS-PAGE检测，观察有无WGF5条带.

1.4.3 扫描电子显微镜观察对肿瘤细胞形态的观察 用镊子将75%乙醇浸泡的盖玻片（22 mm×22 mm）在酒精灯上烤干，放置于六孔板中，加入2 mL B16细胞，104～105个/孔，5%CO2细胞培养箱中37 ℃培养12 h，加入SCM3，继续培养24 h，吸去上清，PBS清洗2次，用2.5%戊二醛溶液固定过夜，PBS缓冲液洗涤细胞2～3次，依次用浓度30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%的乙醇溶液逐步给肿瘤细胞脱水.取下盖玻片，进行扫描电镜观察.

1.4.4 台盼蓝染色分析WGF5对SMMC-7721的毒力 将在六孔板接种的细胞置于细胞培养箱培养12 h，实验组加入10 mg/L WGF5，而对照组加入相同体积的PBS，实验组和对照组都做相同时间梯度：0，24，36，48，60 h.收集细胞PBS洗涤2次后，80 μL无菌去离子水重悬细胞，然后加入80 μL台盼蓝染色液常温染色5 min，细胞用血球计数板进行计数，计算细胞的死亡率.

2 结果与分析

2.1 硫酸铵分级沉淀抗肿瘤活性蛋白

利用硫酸铵分级沉淀梯度分别为0%～35%，35%～70%，70%～100%，40%～75%分级沉淀出的4组蛋白，作用B16 肿瘤细胞 24 h，CCK-8试剂盒测定各组样品的肿瘤细胞抑制率.实验结果如图1-a所示，各饱和度下沉淀的蛋白均对两种肿瘤细胞具有细胞毒性，且 35%～70%饱和度区沉淀出蛋白的细胞毒性为83%，显著高于其他三组蛋白的抗肿瘤活性.硫酸铵分级沉淀浓度为40%～75%时（原方法所使用的硫酸铵分级沉淀浓度梯度），其沉淀出的蛋白细胞毒性在73%左右.SDS-PAGE检测硫酸铵分级沉淀梯度分别为35%～70%（图1-b，泳道1）、40%～75%（图1-b，泳道2）沉淀出的两组样品的蛋白条带发现，二者蛋白成分相近，且35%～70%硫酸铵分级沉淀出的蛋白中WGF5含量较高.因此，考虑选用35%～70%硫酸铵梯度沉淀法沉淀抗肿瘤活性蛋白.

2.2 强阳离子交换色谱分离抗肿瘤活性蛋白

将提取的抗肿瘤活性粗提蛋白用强阳离子交换色谱进行分离，分离结果如图2-a所示，图中出现两个色谱峰，穿透峰（峰A）在色谱程序开始后不久就被洗脱下来，峰面积较大，最高点接近3 500 mAU.紧随峰A被洗脱下来的色谱峰（峰B），保留时间为6.5 min.收集各峰进行细胞毒性实验，并对A和B两活性峰进行SDS-PAGE检测，结果表明WGF5在峰B中.大量收集活性峰B，进行下一步分离纯化.

2.3 分子筛色谱分离抗肿瘤活性蛋白

收集强阳离子交换色谱分离的活性峰进行分子筛色谱.分离结果如图3所示，从图3中可以看出，活性粗提物的分子筛色谱分离共出现了3个峰，其中峰A的色谱峰面积最大，其余2个活性峰的峰面积较小.收集这3个色谱峰进行肿瘤活性实验，结果发现只有峰C的洗脱液有抗肿瘤活性.

2.4 抗肿瘤活性蛋白的纯度检测

将分子筛色谱分离出的活性峰组分，进行12%SDS-PAGE.检测结果如图4所示，泳道1所示只有一个条带，相对分子质量约20 000，确定为目的条带WGF5.

2.5 台盼蓝染色观察WGF5对B16细胞的毒性作用

用4%台盼蓝染色液对WGF5作用不同时间的B16细胞进行染色.早期凋亡的细胞及未死亡的细胞中细胞膜结构较完整，不易被台盼蓝染液染成蓝色，从而可以通过这种染色手段将活细胞与死细胞区分开来.从图5可以看出，随作用细胞的时间增大，被染色的死细胞数目比例逐渐增加.在WGF5作用48 h后，细胞死亡比例达到了67%，而之前CCK-8试剂盒测得细胞死亡率在67%之上，可以分析得出在CS3作用细胞期间，细胞可能发生了早期凋亡.

2.6 扫描电子显微镜观察细胞形态变化

扫描电子显微镜观察WGF5对B16细胞形态的影响，结果如图6所示，在对照组中， B16细胞具有明显的细胞形态变化，细胞形态正常.实验组中B16细胞的细胞伪足消失，细胞结构坍塌瓦解，细胞变圆死亡，足见WGF5对人脐带静脉内皮细胞没有明显的毒力.

3 讨论

粘细菌是最高级的微生物类群，科研工作者从中挖掘抗肿瘤新药物的研究体系也日趋完善[14].就目前研究现状来看，粘细菌抗肿瘤新药物的开发潜力远大于放线菌[15].2014年Jansen等从粘细菌Nannocystis pusilla Na a174菌株中分离得到的pyrronazols C1和C2两种活性物质对多种肿瘤细胞系均有抑制作用，其中对人卵巢癌细胞SK-OV-3的活性最好[16].Tubulysin是具有抗肿瘤细胞活性的多肽类化合物，从Archangium Gephyra中分离获得，Tubulysin A抑制肿瘤细胞有丝分裂，可以使癌细胞周期被停滞在G2/M并最终走向死亡[17-18].

文也等[13]從Myxococcus macrosporus STXZ54中分离到的WGF5是一种相对分子质量约为20 000的活性蛋白，能很好地抑制B16及Hela等多种肿瘤细胞，在所测试的细胞系中显示出高效的抗肿瘤活性.但WGF5的分离纯化方法较为耗时，步骤略显繁复，导致WGF5的分离效率较低.本文在文也等[13]研究的基础上，优化了对Myxococcus macrosporus STXZ54抗肿瘤活性蛋白WGF5的分离纯化方法，找到更为适合的硫酸铵分级沉淀蛋白的浓度梯度：35%～70%的硫酸铵梯度下沉淀出的蛋白比原浓度梯度（40%～75%）沉淀出的蛋白表现出更高的抗肿瘤活性，且保留了目的条带.另外用强阳离子交换柱代替弱阳离子交换柱进行粗提样品的分离，发现强阳离子交换更易结合STXZ54抗肿瘤活性蛋白组分.同时将色谱柱Sephadex G75更换为Sephadex 200 10/300，其孔径更适合STXZ54活性蛋白的分离.SDS-PAGE检测分子筛活性峰，结果显示为一条带，大小在20 000左右，即WGF5条带.优化后的WGF5分离纯化方法，省去了反相色谱分离步骤，同时优化了各色谱分离中流动相配方、流速等，进一步提高了WGF5的分离纯化效率.

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