雷公藤内酯醇对佐剂性关节炎大鼠关节组织ＭＣＰ－１表达变化的影响|雷公藤多苷片
时间：2019-01-26 05:00:53 来源：达达文档网 本文已影响 人 
关键词 雷公藤内酯醇 佐剂性关节炎 单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1) 实验研究 类风湿性关节炎是临床上的常见病及多发病，若得不到及时诊治，其致残率极高。雷公藤内酯醇是雷公藤主要成分之一，其药理活性最高，在临床上用于治疗类风湿性关节炎，近期疗效很高。笔者以往的研究表明［1］雷公藤内酯醇可抑制MCP-1对佐剂性关节炎大鼠外周血T淋巴细胞的趋化作用。但雷公藤内酯醇对佐剂性关节炎大鼠关节组织细胞MCP-1表达变化的影响如何，尚未见文献报道。本研究旨在建立大鼠佐剂性关节炎模型基础上，通过应用不同剂量的雷公藤内酯醇，观察其对佐剂性关节炎病变组织细胞趋化因子MCP-1表达变化的影响，探讨雷公藤内酯醇治疗类风湿性关节炎相关的作用机理。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂：雷公藤内酯醇(福建省医学科学研究所，纯度为99.95％，批号：20050422)，溶于2％丙二醇，用200目滤器过滤除菌后备用。福氏完全佐剂(FCA)(上海华美生物工程有限公司)。兔抗大鼠单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)多克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG、SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。RY-2000瑞医病理图文分析系统(东南大学瑞医科技产品)。一步提取RNA试剂盒(BBl，USA)，Taq酶(Takara，Japan)，AMVRtaseXL(Takara，Japan)，珀金-埃尔默DNA扩增仪9600(PERKIN ELMER)，凝胶电泳成像分析仪(BiokAD，USA)，所有引物(上海生工生物工程技术与服务有限公司)。
1.2 动物分组：SD大鼠50只，由浙江大学医学院实验动物中心提供，雌雄不限，体重200－250g，自由饮食，适应性喂养7天后随机分成5组：①空白对照组(A组)；②佐剂性关节炎模型组(B组)；③低剂量(0.1mg／kg)雷公藤内酯醇治疗组(C组)；④中剂量(0.2mg／kg)雷公藤内酯醇治疗组(D组)；⑤高剂量(0.4mg／kg)雷公藤内酯醇治疗组(E组)。每组10只。
1.3 佐剂性关节炎模型的建立：福氏完全佐剂(FCA)制备，将液体石蜡和羊毛脂(2∶1)共热至70℃高压灭菌后，按每毫升加入卡介苗10mg制成。佐剂性关节炎诱发：用微量注射器于右后足跖皮内注射FCA0.1ml，约14天左右可诱发成功佐剂性关节炎模型，空白对照组注射等量生理盐水。
1.4 实验过程和方法：各组动物处理：佐剂性关节炎诱发的第15天，A组及B组动物右后足关节上方肢体肌肉注射等容积的2％丙二醇溶液，每天1次，连续5天；C组、D组和E组动物给予雷公藤内酯醇治疗，剂量分别为0.1mg／kg、0.2mg／kg和0.4mg／kg，于病变关节上方肢体肌肉注射，每天1次，连续5天，于实验的第21天所有大鼠行心脏穿刺取血后处死。将实验关节组织提取进行MCP-1的RT-PCR检测和MCP-1免疫组织化学染色观察。
1.5 观察指标：分述如下。
1.5.1 组织学观察：实验结束处死动物后，提取各组动物右后踝关节组织标本，福尔马林液固定，脱钙，常规制片，H.E染色镜检。
1.5.2 MCP-1的RT-PCR检测：①RNA分离提取：总RNA提取程序按BBI公司TRIzol试剂盒说明操作。②RT-PCR：总RNA 1μg，逆转录反应液25μl，其中含有2x逆转录缓冲液12μl，dNTPs(10mM)2μl，MgCl�2(25mM)4μl，oligo dT引物(50μM)0.4μl，16URNAase抑制剂，2UAMVRtaseXL。RT反应在46℃进行45min。PCR反应体系(25μl)，其中，10xPCR缓冲液2.5μl(加Mg��2+�)，dNTp(10mM)2μl，上游引物(250nM)0.2μl，下游引物(250nM)0.2μl，RT产物(cDNA)2μl，1U Ex Taq。GAPDH作为内参照，MCP-1引物序列为：上游，5’-TGT TGT TCA CAG TTG CTG CCT G-3’，下游，5’-GTG CTG AAG TCC TTA GGG TTG ATG-3’。GAPDH引物序列为：上游5’-TGA TGA CAT CAA GAA GGT G-3’；下游5’-TCC TTG GAG GCC ATG TAG GCC AT-3’。扩增产物MCP-1为312bp，GAPDH为240bp。MCP-1扩增程序为35次循环，64℃退火1min；GAPDH为30次循环，60℃退火1min。变性为94℃，1min；延伸为72℃，1min。PCR产物用含有EB的1.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳。用凝胶电泳成像分析仪分析结果。结果用扩增目的基因产物与GAPDH光密度的比值表示。
1.5.3MCP-1免疫组织化学染色观察：取实验关节组织石蜡包埋块切片，用SABC法免疫组化染色，主要步骤为：常规脱蜡至水，滴加3％H�2O�2室温5min；滴加10％正常羊血清室温10min，勿洗；滴加兔抗大鼠MCP-1多克隆抗体(1∶350)，4℃、24h；滴加生物素化羊抗兔IgG二抗(1∶200)37℃，1h；滴加SABC37℃，1h；随后进行DAB-H2O2显色5－8min；阴性对照实验用PBS代替一抗，其余步骤相同。每步之间用0.1mol／L PBS(pH7.4)洗3次，每次5min。常规脱水、透明、封片。结果判断：显微镜下滑膜组织细胞胞浆呈棕色着色者为阳性细胞。免疫组化染色结果用RY-2000瑞医病理图文分析系统进行光密度测算。
1.6 统计学处理：所有数据以均数和标准差(x±s)表示，各组均数与显著性检验用SPSS11.0 for windows软件分析。
2 实验结果
2.1 雷公藤内酯醇对大鼠右后踝关节组织病理变化影响：镜下见A组右后踝关节组织结构正常，未见炎细胞浸润及充血水肿。B组关节滑膜组织见大量淋巴细胞和单核细胞浸润，关节软骨有轻度破坏，可见滑膜组织有退变现象。而经雷公藤内酯醇治疗后，C、D和E组三组滑膜组织内炎细胞浸润明显减少，未见组织破坏。随着雷公藤内酯醇治疗剂量增加，关节腔内及其周围组织炎症反应程度逐渐明显减轻。
2.2 雷公藤内酯醇对各组大鼠病变关节组织MCP-1的RT-PCR检测结果影响：A组动物关节组织MCP-1mRNA水平较低，B组动物关节组织MCP-1mRNA水平较A组显著增加，C、D、E组三治疗组关节组织MCP-1mRNA水平较B组明显下降，但仍较A组升高，结果见图1、图2。
2.3 雷公藤内酯醇对各组大鼠病变关节组织MCP-1表达的影响：正常对照组(A组)大鼠关节组织见少量阳性细胞。关节炎模型组(B组)大鼠关节组织见大量MCP-1免疫染色阳性细胞，主要分布于滑膜细胞，少部分分布于血管内皮细胞。应用雷公藤内酯醇治疗后，C、D、E三治疗组大鼠关节组织MCP-1免疫染色阳性细胞积分光密度值较B组明显减少，三治疗组与B比较差异有显著性，结果见表1。
图1 雷公藤内酯醇(TL)对佐剂性关节炎大鼠关节滑膜组织MCP-1mRNA表达变化的影响
注：1为空白对照组(A组)MCP-1基因表达。2为佐剂性关节炎模型组(B组)MCP-1基因表达。3为雷公藤内酯醇(0.1mg／kg)治疗组(C组)MCP-1基因表达。4为雷公藤内酯醇(0.2mg／kg)治疗组(D组)MCP-1基因表达。5为雷公藤内酯醇(0.4mg／kg)治疗组(E组)MCP-1基因表达。
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3 讨论
佐剂性关节炎(AA)是一种以关节滑膜组织慢性增生为主要表现的免疫功能障碍性关节炎，其关节炎特征较为接近人的类风湿性关节炎。佐剂性关节炎表现为关节滑膜上大量的淋巴细胞、单核细胞等炎细胞浸润。研究显示［6］，RA发病时血管内各种白细胞游出血管进入关节滑膜的选择性浸润与CC、CXC亚族趋化因子(chemokine，CHK)及其受体的相互作用有关。CC亚族中MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1)是在RA发病中起主要作用的趋化因子［3］。它主要来源于RA滑膜组织细胞及浸润其间的单核巨噬细胞、淋巴细胞；并且在IL-1β和TNF-α刺激下，滑膜组织中浸润炎细胞将提高分泌趋化因子的水平［4，5］。MCP-1主要趋化单核细胞、T淋巴细胞，而这两种细胞在RA关节滑膜中浸润数量最多。
本研究发现，A组大鼠关节组织MCP-1mRNA水平及MCP-l蛋白表达水平较低，B组大鼠关节组织MCP-1mRNA水平及MCP-1蛋白表达水平较A组显著增加，结果提示，趋化因子MCP-1参与了佐剂性关节炎发病过程。与有关文献报道的结果相符［5］。本实验中，应用雷公藤内酯醇治疗后，C、D、E三治疗组大鼠关节组织MCP-1mRNA水平及MCP-1蛋白表达水平较B组明显下降。结果提示：雷公藤内酯醇在0.1－0.4mg・kg-1剂量范围内，能降低大鼠关节组织MCP-1mRNA水平，抑制MCP-1蛋白表达，该作用随着雷公藤内酯醇治疗剂量增加而显著加强。
本研究结果表明，雷公藤内酯醇在0.1－0.4mg／kg范闱内，能明显减轻佐剂性关节炎大鼠病变关节组织炎症反应的病理损伤程度，与以往的报道结果相符［3］。雷公藤内酯醇能降低大鼠关节组织MCP-1mRNA水平，抑制MCP-1蛋白表达作用，我们认为可能是其治疗类风湿性关节炎的作用机制之一。
趋化因子是由免疫细胞和非免疫细胞分泌的一类细胞因子。趋化因子通过G蛋白耦联的胞膜受体与白细胞相互作用，能趋化白细胞浸润到组织损伤处，并可影响白细胞的表型。MCP-1可以由多种细胞产生，包括滑膜组织细胞、巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞和成纤维细胞［6］。近年来，随着人们对类风湿性关节炎发病机制认识的深入，趋化因子与趋化因子受体相互作用受到广泛重视，趋化因子阻滞剂阻断局部趋化因子生成、中和趋化因子活性或者拮抗趋化因子受体，从而防止类风湿性关节炎的发生、发展，已成为一种新的治疗手段和众多学者研究热点。Gong等［7］对于用完全福氏佐剂诱导的类风湿关节炎模型MLR-1pr小鼠每日注射MCP-1的拮抗剂MCP-1（9-7）能阻止RA的产生，相反用MCP-1能加重关节炎症状，而对于已经产生关节炎的小鼠再用MCP-1（9-7）治疗，在关节肿胀程度，关节破坏，血管翳形成及病理组织改变中可见明显减轻，因为用这种拮抗剂可以竞争性地与CCR5受体结合，不能引起其活化，阻断其正常的生理作用，从而减少滑膜组织中单核细胞浸润。据报道［8，9］，趋化因子与趋化因子受体在选择性迁移淋巴细胞亚群进入炎症病灶中发挥重要作用，类风湿性关节炎患者的滑膜液中淋巴细胞只表达一种趋化因子受体CCR5，而与之相应的配体MCP-1等趋化因子在关节滑膜液中也具有较高水平。因此，雷公藤内酯醇对佐剂性关节炎大鼠病变关节组织细胞上CCR5的影响值得进一步研究。
4 参考文献
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