CDC6,mRNA在弥漫大B细胞淋巴瘤中表达及其临床意义的研究

沈明芳　李园　郭志琴　郭晓珺　曾惠

[摘要] 目的 研究彌漫大B细胞淋巴瘤组织中细胞分裂周期蛋白6（CDC6）表达情况，分析CDC6 mRNA表达与弥漫大B细胞淋巴瘤临床病理特征、预后的关系和意义。

方法 收集2012年1月～2018年12月期间我院60例DLBCL病例，以同期20例淋巴结反应性增生组织作为对照，采用实时荧光定量RCR（real-time PCR）检测其CDC6 mRNA的表达水平，并分析CDC6 mRNA与DLBCL患者临床病理特征及预后的关系。

结果 CDC6 mRNA在DLBCL中的表达量（0.441±0.070）较淋巴结反应性增生组织（0.113±0.029）显著增高（P<0.05）;CDC6 mRNA在DLBCL中的上调与Hans分型中non-GCB亚型存在相关性（P=0.001）;单因素分析显示，高表达CDC6 mRNA、临床分期Ⅲ+Ⅳ期、IPI评分3～5分、LDH升高（>245 U/L）、贫血（Hb<100 g/L）、Hans分型non-GCB 亚型均与DLBCL患者不良预后有关;多因素Cox分析显示，高表达CDC6 mRNA、贫血、non-GCB亚型是影响DLBC预后的独立危险因素（P=0.006;0.001;0.022）。

结论 CDC6 mRNA表达与淋巴瘤关系密切，高表达CDC6 mRNA可能与DLBCL患者不良预后有关，可作为DLBCL患者预后的独立危险因素。

[关键词] 弥漫大B细胞淋巴瘤;细胞分裂周期蛋白 6;非生化中心B细胞样亚型;预后因素

[中图分类号] R733.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）07-0018-05

Expression of CDC6 mRNA in diffuse large B cell lymphoma and its clinical significance

SHEN Mingfang1   LI Yuan1   GUO Zhiqin2   GUO Xiaojun1   ZENG Hui1

1.Department of Hematology， the First Hospital of Jiaxing City in Zhejiang Province， Jiaxing   314000， China; 2.Department of Pathology， the First Hospital of Jiaxing City in Zhejiang Province， Jiaxing   314000， China

[Abstract] Objective To study the expression of cell division cycle protein 6（CDC6） in diffuse large B cell lymphoma（DLBCL）， and to analyze the relationship between the expression of CDC6 mRNA and the clinicopathological features and prognosis of DLBCL. Methods 60 cases of DLBCL treated in our hospital from January 2012 to December 2018 were selected. 20 cases of reactive hyperplasia of lymph nodes in the same period were used as the control group. Quantitative real-time RCR（real-time PCR） was used to detect the expression level of CDC6 mRNA， and the relationship between CDC6 mRNA and clinical pathological characteristics and prognosis of DLBCL patients was analyzed. Results The expression of CDC6 mRNA in DLBCL（0.441±0.070） was significantly higher than that in reactive hyperplasia of lymph nodes（0.113±0.029）（P<0.05）. The up-regulation of CDC6 mRNA in DLBCL was correlated with non-GCB subtype of Hans（P=0.001）. Univariate analysis showed that high expression of CDC6 mRNA， clinical stage Ⅲ+Ⅳ， IPI score 3-5， LDH increase（>245 U/L）， anemia（Hb<100 g/L） and non-GCB subtypes of Hans were all related to the poor prognosis of DLBCL patients. Multivariate Cox analysis showed that high expression of CDC6 mRNA， anemia and non-GCB subtypes were independent risk factors for DLBCL prognosis（P=0.006; 0.001; 0.022）. Conclusion The expression of CDC6 mRNA is closely related to lymphoma. The high expression of CDC6 mRNA may be related to the poor prognosis of DLBCL patients， which can be an independent risk factor for the prognosis of DLBCL patients.

[Key words] Diffuse large B cell lymphoma; Cell division cycle protein 6; Non-germinal center B-cell-like; Prognostic factors

弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是成人侵袭性淋巴瘤中最常见的类型，发病率占NHL的45.8%[1-2]。DLBCL在病理及临床方面呈高度侵袭性和异质性，其组织学形态、免疫表型、分子遗传学特征、临床表现及转归在不同患者间存在明显差异， 不同亚型对治疗的反应及预后不同。随着利妥昔单抗等靶向药物的应用及治疗方案的不断优化，DLBCL患者5年总体生存率（OS）提高至40%～65%[3]，但仍有大量患者面临疾病复发、进展甚至死亡的风险。参照Hans等标准分类[4]，DLBCL可以分为生发中心B细胞样（Germinal center B cell-like，GCB）和非生發中心B细胞样（Non-geminal center B cell-like，non-GCB）型。研究表明，不论是使用CHOP/CHOP样方案还是R-CHOP方案，non-GCB亚型都是DLBCL独立的不良预后因素[5]。

DNA复制是细胞周期中的核心事件，它受到许多因子的调控，以便保证遗传信息精确和完整地传递给子代细胞，细胞分裂周期蛋白6（Cell division cycle 6，CDC6）是细胞增殖和DNA复制所必需的蛋白质，在DNA复制许可阶段起到限制性作用[6-8]。大量研究表明，CDC6具有原癌基因特性，与肿瘤发生、发展密切相关[9-10]，许多肿瘤细胞高表达CDC6。为探讨CDC6在DLBCL中的表达水平及其与临床病理特征、预后的相关性，本研究回顾性分析本院60例接受R-CHOP方案或R-CHOP样方案化疗的DLBCL成人患者的临床资料，检测DLBCL组织中的CDC6 mRNA表达水平，分析其与淋巴瘤患者主要临床特征及预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年1月～2018年12月期间我院病理科根据2008年淋巴造血组织WHO分类诊断标准[1]诊断的DLBCL病例，筛选出临床病历及随访资料相对完整的DLBCL患者60例，纳入本次研究的所有患者均使用一线方案[R-CHOP/CHOP 21联合或不联合利妥昔单抗的CHOP方案（环磷酰胺、表阿霉素或多柔比星脂质体、长春地辛、地塞米松或泼尼松）]方案化疗，部分老年患者使用减量R-CHOP或R-COP方案（不使用蒽环类化疗药）化疗;治疗效果欠理想者后期行二线方案化疗[GDP（吉西他滨、顺铂、地塞米松）、ICE（异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷、表阿霉素）等];其中2例患者因不能耐受化疗后期仅接受支持疗法。以同期20例淋巴结反应性增生组织作为对照组。

1.2 方法

对全部患者进行一般临床特征分析，包括性别、年龄、血清乳酸脱氢酶（Lactate dehyrogenase，LDH）、血红蛋白（Haemoglobin，Hb）。所有标本在初诊时由病理科切片，使用全自动免疫组化染色机Leica Bond Ⅲ对切片组织LCA、CD20、CD79a、CD3、CD5、CD10、BCL-6、MUM1、BCL-2、Ki-67、CyclinD1、TdT、CD56、UCHL1、CD23、CD21等指标进行免疫组化染色，以明确病理诊断。病理类型参照Hans等标准[4]分类，根据CD10、BCL-6和MUM1的表达情况，分为生发中心型（Germinal center B cell-like，GCB）和非生发中心型（Non-germinal center B cell-like，non-GCB）。患者行淋巴结超声、胸腹部CT、骨髓穿刺等常规检查，部分患者行PET-CT检查。参照Ann Arbor标准进行临床分期，共分Ⅰ～Ⅳ期;根据中国弥漫大B细胞淋巴瘤诊断与治疗指南（2013年版）[2]，IPI评分为0～5分。

1.2.1 Real-Time PCR检测CDC6 mRNA表达  收集DLBCL患者术后或者活检的石蜡标本，取切片组织（5～20 μm）3～4片，采用RNeasy FFPE Kit（Qiagen）和SuperScriptTM Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（Thermo Fisher）对上述细胞分别进行总RNA提取以及第一链cDNA合成，具体步骤参照试剂盒说明书。采用Primer Premier 6.0软件进行定量PCR目的基因及内参引物设计，并由生工生物工程（上海）股份有限公司负责合成，其序列见表1。采用Power SYBRR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）进行qPCR，反应体系：Power SYBRR Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，补充SDW至20 μL。反应条件为 95℃预变性1 min、95℃变性15 s、63℃退火延伸25 s，进行40个循环。每个样品重复3次，CDC6 mRNA相对表达量采用2-△△Ct的方法计算获得。

1.2.2 随访  通过电话咨询、住院病历查询获得随访资料，随访时间为10～89个月，计算患者的总体生存期（Overall survival，OS）。OS指患者从诊断到任何原因死亡或最后一次随访的时间，随访日期截止至2019年9月1日，60例患者中死亡22例。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件进行分析，CDC6 mRNA表达水平采用均数±标准差（x±s）进行统计描述;应用独立样本t检验分析CDC6mRNA表达与DLBCL临床病理特征的关系;应用ROC曲线找出DLBCL中CDC6 mRNA相对表达量（2-△△Ct）高、低的截点值（cutoff值）。采用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析，依据Log-rank检验进行生存曲线的单因素比较;多因素分析采用Cox比例风险模型，找出影响DLBCL生存的独立预后因素，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者临床特征

纳入本次研究的60例DLBCL患者中，男35例，女25例，男女比例1.4：1;年龄19～86岁，中位年龄63岁;血清乳酸脱氢酶水平正常（≤245 U/L）33例，升高（>245 U/L）27例;血红蛋白水平≥100 g/L 47例，<100 g/L 13例;根据Ann Arbor临床分期，Ⅰ+Ⅱ期32例，Ⅲ+Ⅳ期28例;淋巴瘤国际预后指数（IPI）评分0～2分45例，3～5分15例;依据Hans分型，GCB亚型22例，non-GCB亚型38例。

2.2 CDC6 mRNA 在 DLBCL和淋巴结反应性增生组织中的表达

CDC6 mRNA在DLBCL中的表达量（0.441±0.070）较淋巴结反应性增生组织（0.113±0.029）显著增高，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.3 CDC6 mRNA表达量与DLBCL临床病理特征的相关性

non-GCB患者CDC6 mRNA的表达量显著高于GCB型，差异有统计学意义（P<0.05），而CDC6 mRNA表达量与患者的年龄、性别、血清LDH水平、血红蛋白水平、疾病分期、IPI评分及病变部位均无明显的相关性。见表2。

2.3 预后影响因素分析

根据ROC曲线分析，DLBCL患者中CDC6 mRNA表达量的cutoff值为0.300，CDC6 mRNA表达量<0.300定义为低表达，≥0.300定义为高表达（封三图1）。单因素生存分析结果显示：低表达CDC6 mRNA的DLBCL患者平均生存期为（69.272±6.042）个月，明显长于高表达者（30.780±6.756）个月，差异有统计学意义（χ2=11.687，P=0.001）（封三图2），同时，DLBCL患者的临床分期Ⅲ+Ⅳ期、IPI评分3～5分、LDH升高（>245 U/L）、贫血（Hb<100 g/L）、Hans分型non-GCB亚型均与DLBCL患者不良预后有关（P值分别为0.005、0.048、0.003、0.001、0.001），见表3。多因素分析结果显示：高表达CDC6 mRNA（P=0.006）、血红蛋白<100 g/L（P=0.001）、non-GCB（P=0.022）均为DLBCL独立的不良预后因素，见表4。

3 讨论

细胞分裂周期蛋白6（Cell-division cycle 6，CDC6）属于ATP酶家族-AAA+ 成员，通过与细胞分裂周期蛋白10依赖性转录因子1（Cell division cycle 10 dependent transcript 1，CDT1）相互作用水解ATP，进而促进DNA解旋酶-六聚微小染色体维持蛋白复合体装配在DNA上，与起始识别复合体（Origin recognition complex，ORC）共同形成复制前复合体（Pre-replicative complexes，Pre-RC）[6]，控制细胞从G1期进入S期，保证一个细胞周期內DNA复制不会被反复多次启动[11-12]。近年来，大量研究发现CDC6具有原癌基因的特性，CDC6高表达在肿瘤的发生、发展中起重要作用，许多肿瘤细胞高表达CDC6，包括肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、白血病和套细胞淋巴瘤等[13-17]。但CDC6在DLBCL中的表达及其潜在的调控机制仍有待阐明。本研究结果表明，CDC6 mRNA在弥漫大B细胞淋巴瘤中表达明显高于淋巴结反应性增生组织，同时其高表达与non-GCB亚型有关，且差异有统计学意义（P<0.05），但是具体机制还有待细胞生物学和DLBCL动物模型等实验研究来进一步验证。

单因素生存分析显示，高表达CDC6、临床分期Ⅲ+Ⅳ期、IPI评分3～5分、LDH升高、贫血及Hans分型non-GCB亚型均与DLBCL患者不良预后有关;多因素Cox回归分析，高表达CDC6、贫血及non-GCB 亚型可能是DLBCL患者预后不良的独立危险因素。提示CDC6高表达可能是判断DLBCL患者预后的独立危险因素，但是，也不排除我们的数据分析可能会受到回顾性分析、患者数量较少和随访时间较短等因素影响。因此，有必要扩大病例数、随访更长的时间，甚至设计前瞻性研究来进一步检验这些结果。

Pinyol M等[17]研究表明，在套细胞淋巴瘤CDC6和其他DNA复制许可基因如CDT1之间的不平衡在疾病的发生、发展中起重要作用，其机制与p53通路抑制有关。Xiong XD等[18]报道CDC6基因G1321A位点的多态性是NHL特别是DLBCL的不良的预后因素（P=0.012），G1321多态性能改变CDC6 mRNA的次级结构。大量研究表明，通过沉默CDC6基因能阻止细胞增殖和促进凋亡[8]。Feng D等[19]首先验证无论癌细胞中P53是否突变，通过小干扰RNA（siRNA）下调CDC6的表达可诱导肿瘤细胞凋亡，抑制细胞生长，但不影响正常细胞。在BCR/ABL阳性的慢性粒细胞白血病细胞株K562中，利用同样的方法靶向CDC6，获得了类似的效果[16]。Karanika S等[20]也报道了CDC6可提高Chk1/2抑制剂对前列腺癌细胞的治疗作用。本研究表明，CDC6高表达在DLBCL患者non-GCB亚型中确实存在，且其平均生存期较短，大胆设想抑制CDC6的表达对DLBCL患者可能具有潜在的治疗益处，CDC6有可能成为一种有前景的治疗恶性淋巴瘤的突破点。

综上所述，本研究结果表明在DLBCL样本中CDC6表达上调，尤其在DLBCL non-GCB亚型表现更突出，CDC6高表达与DLBCL患者不良预后相关，CDC6可能对DLBCL具有潜在的诊断及治疗价值，可作为DLBCL患者不良预后的独立危险因素。而CDC6在DLBCL中的作用机制和作用的分子靶点、过表达CDC6的致癌潜力以及靶向CDC6治疗淋巴瘤的作用等问题尚需进一步深入研究。

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（收稿日期：2019-11-08）