中药复方灌注剂治疗奶牛乳房炎的药效与应用安全性研究

摘要：治疗奶牛乳房炎的中药复方灌注剂由瓜子金、紫花地丁、鸡血藤和黄芪等１１味中药组方制成。以兔子、小白鼠和豚鼠为试验动物，从镇痛、抗炎、解热、异常毒性、热源检查、溶血与凝集和过敏反应等方面进行了药效与应用安全性研究。试验显示，该中药复方灌注剂对小白鼠镇痛和抗炎效果以及对伤寒－副伤寒二联菌苗致家兔发热反应的解热效果极显著（Ｐ＜０．０１）。通过安全性试验，未发现该中药复方灌注剂引起异常毒性、热敏、溶血与凝集反应和过敏反应。结果表明，该中药复方灌注剂镇痛、消炎和解热效果显著，安全性较高，可用于临床试验。

关键词：奶牛；乳房炎；复方灌注剂；药效；安全性

中图分类号：Ｓ８５７．２＋６；Ｓ８５３．９ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）09－1846-05

Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃａｃｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉnal Ｈｅｒｂｓ Compoud Ｆｉｌｌｅｒ ｆｏｒ Ｄａｉｒｙ

Ｃａｔｔｌｅ ｗｉｔｈ Ｍａｓｔｉｔｉｓ

ＭＥＮＧ Ｑｉｎｇ－ｊｕａｎ１，ＦＥＮＧ Ｓｈｉ－ｂｉｎ１，ＬＩ Ｚｈｉ－ｍｉｎｇ２，ＷＡＮＧ Ｘｉ－ｃｈｕｎ１，ＨＡＮ Ｃｈｕｎ－ｙａｎｇ１，ＺＯＵ Ｓｏｎｇ－ｙａｎｇ２，

ＬＩＵ Ｑｉ－ｓｈａｎ２，ＷＵ Ｊｉｎ－ｊｉｅ１

（1. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｅｆｅｉ ２３００３６， Ｃｈｉｎａ；

２． Ａｎｈｕｉ Ｂａｉｄｉ Ｍｉｌｋ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｈｅｆｅｉ ２３００３１， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｆｉｌｌｅｒ ｗａｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ １１ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂｓ ｓｕｃｈ ａｓ Ｐｏｌｙｇａｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ， Ｖｉｏｌａ ｙｅｄｏｅｎｓｉｓ Ｍａｋｉｎｏ， Ｓｐａｔｈｏｌｏｂｕｓ ｓｕｂｅｒｅｃｔｒｕｓ ａｎｄ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ， ｅｔｃ． Ｒａｂｂｉｔｓ， ｓｍａｌｌ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｆｉｌｌｅｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎａｌｇｅｓｉｃ ｔｅｓｔ， ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ， ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ ｔｅｓｔ， ａｂｎｏｒｍａｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｐｙｒｏｇｅｎ ｔｅｓｔ， ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ｅｔｃ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｎａｌｇｅｓｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｆｉｌｌｅｒ ｉｎ ｓｍａｌｌ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｆｅｖｅｒ ｏｆ ｒａｂｂｉｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｙｐｈｏｉｄ－ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜０．０１）． Ｔｈｅ ｓｅｃｕｒｉｔｙ ｔｅｓｔ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｆｉｌｌｅｒ ｄｉｄ ｎｏｔ ｃａｕｓｅ ａｂｎｏｒｍａｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ， ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ， ａｎｄ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｆｉｌｌｅｒ ｗａｓ ｖｅｒｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ ａｎａｌｇｅｓｉｃ， ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ， ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｓａｆｅ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｄａｉｒｙ ｃａｔｔｌｅ； ｍａｓｔｉｔｉｓ； ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｆｉｌｌｅｒ； ｅｆｆｅｃａｃｙ； ｓａｆｅｔｙ

奶牛乳房炎是乳腺受到物理、化学、微生物等刺激所发生的一种炎性变化［１］，是奶牛常见病和多发病之一。据Ｄａｗｎ报道，在美国每１００头奶牛的乳区发病率为３０％～４０％，平均每头发病奶牛每年使生产者损失超过１００美元，而整个美国每年因奶牛乳房炎造成的损失超过２０亿美元［２］。Ｌｕｎｄ等［３］报道，在丹麦由乳房炎引起的产奶下降及对发病奶牛的治疗，每头奶牛每年损失超过２００美元。长期以来，国内外普遍采用抗生素治疗奶牛乳房炎，虽然疗效较好，但随着抗生素长期大剂量的广泛使用，细菌耐药性的产生和抗生素在乳中的残留问题倍受人们关注。因此，人们不断尝试使用新的药物和新的方法来防治奶牛乳房炎［４］。目前，中药防治奶牛乳房炎的剂型主要有散剂、煎剂、注射剂和透皮制剂。散剂和煎剂是临床最常用的剂型，虽然保留了中药的属性和功能，但是用药剂量较大，成本高，药物在瘤胃内会有一定的损失。透皮制剂是提取中药的有效成分浓缩制成的软膏，采用涂抹的方式给药，虽然避免了散剂剂量大和刺激胃肠道的弊端，但皮肤的角质层对药物的渗透有一定的阻碍作用，使药物在短时间内难以达到有效浓度［５］。灌注液在防治奶牛乳房炎时，主要采用乳池灌注的方式给药，具有剂量准确、作用迅速、给药方便的优点，药物不受消化液和食物的影响，可直接作用于病原微生物，达到杀菌、抑菌的目的。随着研究的不断深入，中药灌注液在防治奶牛乳房炎方面将会有更加广阔的应用前景。

本试验以自制的中药复方灌注剂为研究对象，分别从镇痛、抗炎和解热三个方面对复方灌注剂进行了药效学研究；并通过异常毒性试验、热源检查、溶血与凝集性试验和过敏反应等在安全性方面进行了研究，旨在考察该中药复方灌注剂的药效及其安全性，为该药物在奶牛上的临床应用提供理论依据。

１材料与方法

１．１药物及试剂

药品：瓜子金、甜地丁、紫花地丁、香附、元宝草等购于亳州市济人药业有限公司。

试剂：无水乙醇、生理盐水、去离子水、吐温－８０、针剂活性炭、0.6%醋酸、安痛定、伤寒－副伤寒二联菌苗、伊文思蓝溶液、二甲苯、５％卵蛋白液（自制，取新鲜蛋清５ ｍＬ加氯化钠注射液至１００ ｍＬ，用前配制）等。

１．２试验仪器

电热恒温水浴锅、回流装置、旋转蒸发仪、７５１分光光度计、磁力搅拌器、抽滤装置、垂熔玻璃漏斗、ｐＨ计等。

１．３试验动物

新西兰大白兔、昆明系小白鼠、白色雄性豚鼠等试验动物，均购自安徽医科大学实验动物室，试验前临床健康检查均正常。

１．４试验方法

１．４．１中药复方灌注剂的制备根据中药有效成分的不同分别采用水提醇沉法和蒸馏法相结合的方法提取，并经过进一步的纯化处理，冷藏备用。

１．４．２镇痛试验［６］热板法：将大烧杯固定于水浴锅内，温度调节在（５５±０．５）℃，将雌性小白鼠投入烧杯，测定其痛觉反应时间（以舔后足为指标），共测２次，间隔５ ｍｉｎ，计算２次的平均值作为给药前的痛阈值，其中选取平均值不超过３０ ｓ的小鼠４０只作为正式试验使用。将合格小白鼠标记编号，随机平均分为４组，每组每只小鼠分别皮下注射生理盐水、安痛定、中药复方灌注剂和浓缩为２ ｇ／ｍＬ的该中药复方灌注剂各０．２ ｍＬ，在给药后４５、９０、１３５ ｍｉｎ各测痛觉反应１次，如６０ｓ内无痛反应，则以６０ ｓ计算。试验完毕后，按下式计算痛阈提高百分率：

痛阈提高百分率＝

×１００％

扭体法：选取雄性小白鼠４０只，随机平均分为４组，使用记号笔标记编号。每组每只小鼠分别皮下注射生理盐水、安痛定、中药复方灌注剂和浓缩为２ ｇ／ｍＬ的该中药复方灌注剂各０．２ ｍＬ。在给药后３０ ｍｉｎ各鼠均腹腔注射０．６％醋酸溶液０．２ ｍＬ。观察并记录２０ ｍｉｎ内小鼠出现的扭体次数以及扭体潜伏期。试验完毕后，计算药物镇痛率（以生理盐水组为对照）：

镇痛率＝

×１００％

１．４．３抗炎试验［６］对小白鼠腹腔毛细血管通透性的影响：选取体重１８～２２ ｇ的小鼠３０只，雌雄各半，随机平均分为３组，每组每只小鼠分别皮下注射生理盐水、中药复方灌注剂和地塞米松０．２ ｍＬ。给药后１ ｈ，尾静脉注射２０ ｍｇ／ｍＬ伊文思蓝溶液０．１ ｍＬ，并同时腹腔注射０．６％醋酸溶液０．２ ｍＬ。２０ ｍｉｎ后，颈部脱臼处死，剪开腹腔，用去离子水冲洗腹腔３次，用吸管吸取腹腔洗出液５ ｍＬ，２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，取上清液于590 nm处测定ＯＤ值。

对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响：选体重２０～２５ ｇ小鼠雌雄各半共３０只，随机分为３组，每组１０只并编号标记。每组每只小鼠分别皮下注射生理盐水、地塞米松和中药复方灌注剂各０．2 ｍＬ。给药３０ ｍｉｎ后，于小鼠右耳两面涂二甲苯０．１ ｍＬ致肿，左耳不涂；１ ｈ后颈部脱臼处死，用６ ｍｍ打孔器冲下左耳和右耳同一部位的圆片称重。计算肿胀率、肿胀度（右耳重量减去左耳重量）。耳肿胀率按下式计算：

耳肿胀率＝×１００％

１．４．４对伤寒-副伤寒二联菌苗致家兔发热反应的影响［７］取体重ｌ．５～３．０ ｋｇ的合格新西兰大白兔１８只，雌雄各半，随机平均分为３组，生理盐水组０．６ ｍＬ／ｋｇ灌胃；阿司匹林组０．１ ｇ／ｋｇ灌胃给药；中药复方灌注剂组０．６ ｍＬ／ｋｇ灌胃给药。给药后测正常体温值２次，然后经家兔耳缘静脉注入１．０ ｍＬ／ｋｇ的伤寒-副伤寒二联菌苗，０．５ ｈ后测量１次体温，而后每隔１ ｈ测肛温１次，共测６次。

１．４．５异常毒性试验［８］根据《中华人民共和国兽药典（２００５年版）》上的规定进行检测。

１．４．６热源检查［８］根据《中华人民共和国兽药典（２００５年版）》上的规定进行检测。

１．４．７溶血与凝集检查［８］取洁净试管５只，编号，１、２号管为供试品管，３号管为阴性对照管，４号管为阳性对照管，５号管为供试品对照管。按表１所示依次加入供试药液、生理盐水、去离子水、２％红细胞混悬液，混匀后，立即置于（３７±０．５）℃的恒温箱中进行温育，３ ｈ后观察溶血和凝集反应。

１．４．８过敏反应检查［９］取健康豚鼠１８只，体重２５０～３５０ ｇ，随机分成３组，每组６只。每组豚鼠隔日连续３次分别腹腔注射中药复方灌注液、生理盐水、５％卵蛋白液各０．５ ｍＬ／只致敏。腹腔注射给药后的第１４天，各组分别取出３只豚鼠，由前肢静脉分别注射中药复方灌注液、生理盐水及５％卵蛋白液各１ ｍＬ进行攻击，观察静脉注射后１５ ｍｉｎ内有无过敏反应症状。各组剩余的３只豚鼠于首次腹腔注射后的第２１天进行上述攻击，观察有无过敏反应症状。

２结果与分析

２．１镇痛试验

利用热板法试验检测中药乳房灌注剂的镇痛效果见表２。由表２可见，中药乳房灌注剂用药后，小白鼠的痛阈值均升高，痛阈提高百分率较生理盐水组均显著增加，镇痛效果极显著（Ｐ＜０．０１），其中，灌注剂高剂量组的镇痛效果优于低剂量组和安痛定组，在９０ ｍｉｎ和１３５ ｍｉｎ时的镇痛效果与低剂量组和安痛定组相比差异均极显著（Ｐ＜０．０１）。

扭体法试验检测中药乳房灌注剂的镇痛效果见表３。由表３可见，灌注剂高剂量组、安痛定组、低剂量组与生理盐水组相比，均可显著抑制０．６％醋酸所致小鼠的扭体反应，且镇痛效果高剂量组与低剂量组和生理盐水组相比差异均达极显著水平（Ｐ＜０．０１），高剂量组与安痛定组之间无显著差异（Ｐ＞０．０５）。

２．２抗炎试验

中药复方灌注剂对小白鼠腹腔毛细血管通透性影响的结果见表４。由表４可见，中药复方灌注剂与地塞米松可以极显著降低小鼠腹腔毛细血管通透性（Ｐ＜０．０１），中药复方灌注剂组与地塞米松组相比差异不显著（Ｐ＞０．０５）。

中药复方灌注剂对二甲苯所致小鼠耳肿胀影响的结果见表５。由表５可见，中药复方灌注剂组与地塞米松组小鼠耳廓平均肿胀率均极显著低于生理盐水组（Ｐ＜０．０１），中药复方灌注剂组与地塞米松组相比差异不显著（Ｐ＞０．０５）。

２．３解热试验

该中药复方灌注剂对伤寒-副伤寒二联菌苗所致家兔发热体温的影响结果见表６。由表６可见，在２.0、３.0、４.0 ｈ时，该中药复方灌注剂对家兔发热体温的影响与生理盐水组相比差异均极显著（Ｐ＜０．０１），具有明显的解热作用，且与阿司匹林组无显著性差异（Ｐ＞０．０５），但其解热作用较阿司匹林慢。

２．４异常毒性试验

通过７ ｄ的异常毒性试验观察，发现没有小白鼠死亡，中药复方灌注液低剂量组和中剂量组的小白鼠与生理盐水组反应无差别，精神状态和食欲良好；中药复方灌注液高剂量组的小白鼠第一天精神状态有稍许萎靡，被毛凌乱无光泽，食欲欠佳，第二天状态好转，恢复正常。

２．５热源检查

热源检查结果见表７。试验过程中兔的体温变化不明显，５只兔体温升高的温度分别为０、０．３、０．３、０．４和０．３ ℃，每只家兔的体温升高均在０．６ ℃以下，５只家兔体温升高总和为１．３ ℃。

２．６溶血与凝集检查

温育３ ｈ后观察试验结果，４号阳性对照管产生红色透明溶液，管底无红细胞残留，发生溶血；３号阴性对照管溶液红细胞全部下沉，上清液无色澄明，无溶血和凝集；５号管中药颜色未发生变化，澄明度很高；１、２号管内为供试药品试验组，均未见溶血和红细胞凝集现象发生。

２．７过敏反应检查

过敏反应检查的试验结果显示，攻击注射５％卵蛋白液组豚鼠出现跳动、痉挛、呼吸困难，５ ｍｉｎ内全部死亡。中药复方灌注液组和生理盐水组豚鼠分别用攻击液注射后，１５ ｍｉｎ内两组豚鼠均未出现抓鼻、干咳、竖毛、呼吸困难、颤抖、休克等过敏反应症状。

３讨论

３．１奶牛乳房炎的辨证施治

中兽医学认为，乳房炎属乳痈，是痰、湿、气、血郁结不散，化而为炎；或因饲养管理不善、胃热壅盛、肝郁气滞、牛犊吸乳时咬伤乳头等而导致该病［１０］。因此，组方应以活血化瘀、清热解毒、消肿散结、通经下乳为原则［１１］。本试验选用的这１１味中药在临床上应用效果均较好，其中瓜子金、甜地丁、紫花地丁等具有清热解毒、活血消肿、止痛和抗菌消炎等功效，在复方中为主药，具有良好的清热解毒和活血化瘀的作用，对于缓解乳房炎发病的基本症状有疗效。鸡血藤、青皮等具有祛瘀止痛、调节免疫力的功效，因而可以减轻因热毒壅滞引起的疼痛。

３．２中药复方灌注剂的镇痛作用

炎症常常伴有疼痛，炎症介质可激活伤害性感受器而引起疼痛，从而影响奶牛采食等正常生理活动。本试验采用热板法和扭体法测定了中药复方灌注剂对物理和化学因素所致小鼠疼痛的抑制作用，结果表明中药复方灌注剂高剂量组和低剂量组的镇痛效果均显著（Ｐ＜０．０１），该中药复方灌注剂具有很好的镇痛作用。

本试验方剂所选药物半枝莲、鸡血藤和青皮等具有明显的镇痛功效。有研究表明，１００～４００ ｍｇ／ｋｇ半枝莲总黄酮灌胃给药均可显著抑制醋酸所致的小鼠扭体疼痛反应，剂量相关性明显，大剂量疼痛抑制率与阿斯匹林相近，中剂量疼痛抑制率与双黄连胶囊相近［１２］。许蓬娟等［１３］采用不同镇痛试验方法证明２５％、５０％和１００％ ３种浓度的鸡血藤水煎液均有镇痛作用，且镇痛效果均极显著（Ｐ＜０．０１）。

３．３中药复方灌注剂的抗炎作用

奶牛乳房炎的临床表现症状主要是炎症反应，本试验采用0.6%醋酸致小鼠腹腔毛细管通透性升高和二甲苯致小鼠耳廓肿胀的方法，制造急性炎症模型。结果发现中药复方灌注剂对0.6%醋酸所致腹腔毛细血管通透性升高和二甲苯所致小鼠耳肿胀的急性炎症均具有明显的抑制作用（Ｐ＜０．０１），表示中药复方灌注剂对组织水肿、体液渗出和毛细血管通透性增大等炎症过程有明显的抑制作用。

中药复方体现的是整体协同作用，方中瓜子金为主药，其皂苷类成分是发挥抗炎活性的主要成分［１４］，紫花地丁中主要含香豆素类成分，其中秦皮乙素具有明显的抗炎作用［１５］。研究表明，半枝莲中的汉黄芩素、黄芩苷和黄芩苷元有明显的抗炎活性，可抑制角叉菜胶引起的小鼠足肿胀［１６］。

３．４中药复方灌注剂的解热作用

本试验采用注射伤寒-副伤寒二联菌苗制造家兔发热模型，灌胃给药后发现该中药复方灌注剂对家兔发热体温的影响显著（Ｐ＜０．０１），表示该药具有明显的解热作用。

该复方中的紫花地丁、半枝莲和香附等具有显著的清热解毒作用。有研究表明，半枝莲水煎剂１０ ｇ／ｋｇ对正常大鼠的体温无明显影响，而对皮下注射干酵母引起的发热大鼠具有明显的解热作用，并有一定的剂量依赖关系［１７］。欧润妹等［１８］对香附不同溶剂提取物解热镇痛效应作了比较，结果香附醇提物解热效应明显，其特点是起效快，持续时间长，且有较强的镇痛作用，而香附水提物未见明显的解热效应。

３．５中药复方灌注剂的给药安全性

应用中草药治疗动物疾病在我国有着悠久的历史，随着制药新技术的发展，新的中药剂型不断出现，中药开发应用呈现出良好的发展势头。但是中药并非是完全的无任何毒副作用，许多中药及其复方制剂在较大给药剂量、特定的给药方法和途径时，对敏感的动物会表现出不同程度的毒副作用。

为了保证中药复方灌注剂临床用药安全有效，本研究对其灌注用药的安全性进行了研究。结果表明，不同剂量的中药复方灌注剂对小白鼠均未产生异常毒性反应，对大白兔和豚鼠未引起致热和过敏反应，没有发生溶血与凝集现象。

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