槟榔植原体膜蛋白基因的克隆及其抗血清制备
时间：2020-10-28 08:03:57 来源：达达文档网 本文已影响 人 
摘 要 根据实验室测得的槟榔植原体膜蛋白基因（AcPmp）序列设计1对特异引物mp-FP/mp-RP，以病样槟榔总DNA为模板扩增该AcPmp的编码区并连接到pMD19T simple中间载体。将测序正确的阳性菌提取质粒pMD19T-AcPmp，经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后回收AcPmp片段，然后以正确的编码框连接到原核表达载体pET32a（+），转化Escherichia coli BL21感受态细胞。含有pET32a-AcPmp的BL21表达菌经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明，在30 ℃，0.1 mmol/L IPTG条件下诱导4 h，可产生部分可溶性的融合蛋白。利用Ni2+-NTA亲和层析柱法进行纯化并获得高纯度的可溶性融合蛋白。将纯化后的融合蛋白多次免疫家兔，取其抗血清，以融合蛋白（1 ∶ 10 000稀释）作抗原，间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。Western Blot杂交结果表明槟榔植原体膜蛋白抗血清能与融合蛋白特异性结合。
关键词 槟榔植原体；膜蛋白基因；原核表达；抗血清制备
中图分类号 S59 文献标识码 A
Abstract Total DNA was extracted from the infected Areca and used for amplifying the membrane protein gene of Areca Phytoplasma by using primers mp-FP/mp-RP based on its sequence from previous study. The membrane protein gene was finally inserted into prokaryotic expression vector pET-32a（+）and the recombinant plasmid pET32a-AcPmp was identified by NcoⅠ/XhoⅠ restriction enzymes and Sanger sequencing. Subsequently the recombinant plasmid was transferred into Escherichia coli BL21 competent cell， and the positive colony was induced at 30 ℃ with 0.1 mmol/L IPTG for 4 hours. The result showed that small part of soluble fused protein was expressed and then purified by Ni2+-NTA agarose affinity chromatography， and the high purity of fused protein was finally obtained in 500 mmol/L imidazole Elution buffer. Two rabbits were immunizeed for 3 times by using purified protein and phosphate buffer control the antiserum against Phytoplasma MP was collected and indirect. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay（ID-ELISA）indicated that the titer of antiserum was higher than 1 ∶ 125 000. Western Blot analysis further showed that the antiserum was specifically binding with the MP fused protein.
Key words Areca phytoplasma； Membrane protein gene； Prokaryotic expression； Preparing anti-serum
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.024
槟榔（Areca catechu Linnaeus）属棕榈科槟榔属（Areca）多年生常绿乔木，是一种典型的热带经济作物和观赏作物，也是重要的南药资源之一。据报道，在中国海南省，槟榔是第二大经济作物。而槟榔黄化病是槟榔上主要的病害之一，现已遍及印度、中国等大部分槟榔生产国主产区，造成槟榔大面积减产，并且有进一步扩大的趋势。1976年后，国内外科研工作者通过各种方法证实了在发病的槟榔中存在植原体[1-7]，但是植原体是否为槟榔黄化病的真正病原还在进一步研究当中。
植原体（Phyltoplasm）原称类菌原体（mycoplasma like-organism，MLO），是一类无细胞壁的植物病原微生物，其基因组较小（约0.53～1.35 Mb）[8-9]，（G+C）含量较低（约25 mol），在系统分类学上植原体属于柔膜体纲（Mollicutes）[10]。就物种起源而言，植原体被认为是厌氧植原体属中形成的一个单元演化分枝；从进化学说而论，植原体来自于革兰氏阳性菌，梭菌属细菌的祖先[11]。植原体不能人工培养，主要寄生于植物韧皮部筛管细胞中，可引起植物植株黄化、丛枝、花变叶、矮缩或花器返祖等症状，给经济作物造成巨大的损失[12]。自1967年由Doi首次报道植原体以来，至今已发现有300多种植物的病害与植原体相关，其中在中国已报道的约74种[13-15]。由于植原体没有细胞壁，菌体细胞膜直接与寄主植物或虫媒介体细胞接触，因此，认为其膜蛋白可能在虫媒介体-植原体-寄主植物的相互关系中起着非常重要的作用[16-21]。
