消脂护肝胶囊对NAFLD大鼠瘦素、胰岛素抵抗的影响

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[摘要] 目的 观察中药消脂护肝胶囊对非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠的治疗作用，探讨其可能的作用机制。 方法 采用复合因素复制大鼠NAFLD模型，选取健康雄性SD大鼠72只，按体重随机分为6组，每组12只：空白对照组（简称空白组）、模型对照组（模型组）、东宝肝泰对照组（东宝组）、消脂护肝胶囊高剂量组（消高组）、消脂护肝胶囊中剂量组（消中组）、消脂护肝胶囊低剂量组（消低组）。观察各组大鼠的血糖、血清瘦素（LP）、胰岛素，丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）；血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（（TG）；肝组织病理学。 结果 与模型组比较，消高组、消中组的LP及胰岛素抵抗（IR）指数均明显下降（P<0.01）；与模型组比较，消高组（P<0.01）、消中组（P<0.05）的肝细胞脂变率明显降低。 结论 消脂护肝胶囊能降低血清LP水平，改善IR状态，对NAFLD有良好的防治作用。

[关键词] 非酒精性脂肪肝；瘦素；胰岛素抵抗；消脂护肝胶囊

[中图分类号] R575.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）08（b）-0011-04

Influence of Xiaozhihugan Capsule on leptin and insulin resistance in NAFLD rats

NIE Shan-wen1 ZHAO Wen-xia2▲ SHI Yan-fen3 DONG Jing4 LIU Xiao-yan5 MA Su-ping2

1.Endoscopy Center，Traditional Chinese Medicine Hospital of Henan Province，Zhengzhou 450002，China；2.Department of Spleen，Stomach，Liver and Gall，the First Hospital Affiliated to Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China；3.Department of Traditional Chinese Medicine，Jiaozuo People′s Hospital in Henan Province，Jiaozuo，454002，China；4.Department of Liver，Gall，Spleen and Stomach，Zhumadian Hospital of Traditional Chinese Medicine in Henan Province，Zhumadian 463000，China；5.Inheritance Studio of Famous Traditional Chinese Medicine Physician，Kaifeng Hospital of Traditional Chinese Medicine，Kaifeng 410200，China

[Abstract] Objective To observe the treatment role of Xiaozhihugan Capsule of Chinese medicine for rats with nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD），and to discuss its possible mechanism of action. Methods NAFLD model of rate was copied using composite factor.72 healthy and male rats were divided into 6 groups，and there were 12 rats in each group：blank control group （blank group），model control group （model group），dongbaogantai control group （dongbao group），Xiaozhi Hugan Capsule high dose group （Xiaogao group）， Xiaozhi Hugan Capsule middle dose group （Xiaozhong group）， Xiaozhi Hugan capsule low dose group （Xiaodi group）.Blood sugar，serum leptin （LP），insulin；serum alanine aminotransferase （ALT），aspartate aminotransferase （AST）；serum total cholesterol （TC），triglyceride （TG）；liver tissue pathology was observed of rats in each group respectively. Results Compared with model group，LP and insulin resistance （IR） index in Xiaogao group and Xiaozhong group was obviously decreased respectively （P<0.01）；Compared with model group，fat change rate of liver cell in Xiaogao group （P<0.01） and Xiaozhong group （P<0.05） was obviously decreased respectively. Conclusion Xiaozhihugan Capsule can reduce serum LP level，improve insulin resistance，and has good preventive and therapeutic role for NAFLD.

[Key words] Nonalcoholic fatty liver；Leptin；Insulin resistance；Xiaozhihugan Capsule

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征[1]。随着人们饮食结构的改变，近年来，NAFLD已成为我国常见的慢性肝病之一[2]。据美国等西方国家报道，1/3以上的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者可因持续性肝损伤而导致纤维化进展，发展至终末期肝硬化，并出现肝硬化严重并发症，最终需要肝移植治疗[3]。本课题重点观察消脂护肝胶囊对NAFLD大鼠瘦素、胰岛素抵抗及病理的影响，籍此探讨该药防治NAFLD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠72只，体重（190±10）g，购于郑州大学医学院实验动物中心。

1.2 实验药物

消脂护肝胶囊：河南中医学院第一附属医院制剂室（0.5 g/粒），注册号：豫药制字Z04010393；批号：050315；东宝肝泰片：中国通化东宝药业股份有限公司，批号：050716。

1.3 主要实验试剂

胰岛素试剂盒：解放军总医院科技开发中心放免所，批号：051125；瘦素试剂盒：解放军总医院科技开发中心放免所，批号：051125。

1.4 实验仪器

7150型全自动生化分析仪：日立；DL-8R 冷冻离心机：上海市离心机械研究所；PM-10AD光学显微镜：Olympus Optical Co.，LTD.，Japan；H-750透射电子显微镜：由河北医科大学电镜实验室提供。

1.5 实验方法

1.5.1 分组与模型制备

分组：健康雄性SD大鼠72只，按体重随机分为6组，每组12只，即空白对照组（简称空白组）、模型对照组（模型组）、东宝肝泰对照组（东宝组）、消脂护肝胶囊高剂量组（消高组）、消脂护肝胶囊中剂量组（消中组）、消脂护肝胶囊低剂量组（消低组）。

模型制备：常规饲养1周后，除空白对照组予基础饲料外，其余5组均饲以高脂饲料（84%基础饲料+10%猪油+5%蛋黄粉+1%胆固醇），于造模第1天按照150 mg/kg腹腔注射四环素，其后每6天一次按照100 mg/kg腹腔注射四环素，共计6次，并于第0、6、12、18、24、30天称量体重，相应调整给药量。

1.5.2 给药方法

自造模第2周起，消脂护肝胶囊配制成不同浓度的混悬液，消高组、消中组、消低组分别按照1.5、0.75、0.375 g/（kg·d）剂量灌胃，相当于成人用药量的20、10、5倍；东宝肝泰溶于蒸馏水中，配制成浓度为0.06 g/ml的混悬液，按照0.6 g/（kg·d）剂量灌服，相当于成人用药量的10倍；模型组按照10 ml/kg灌服生理盐水。

1.5.3 标本采取

于第6次腹腔注射四环素1周后，处死各组动物。方法：禁食12 h，不禁水。次日称重，以10%水合氯醛溶液3 ml/kg腹腔内注射麻醉，经腹主动脉穿刺采血4～7 ml，摘取肝脏，称量肝湿重；取肝左叶0.5 cm×1 cm×0.3 cm 大小的组织标本2～3块，置于10%甲醛液中固定，常规HE染色，光镜下观察肝脏病理学变化。

所采非抗凝血液置于洁净干燥试管内，静置半小时后，上离心机（3000 r/min，10 min），取上清液待检。

1.5.4 指标测定

1.5.4.1 一般情况观察、肝指数的测定 ALT、AST、TG、TC、GLU的测定；取新鲜肝组织称重，计算肝湿重（g）与体重（g）之比值，即为肝指数。

1.5.4.2 瘦素、胰岛素的测定 采用放射免疫法，严格按照试剂盒说明书操作步骤，使用GC-911γ放射免疫计数器，检测血清中瘦素、胰岛素的含量（由河南中医学院第一附属医院同位素室协助完成）。

1.5.4.3 胰岛素抵抗指数的计算 按照稳态模式评估HOME法[4]：血糖×胰岛素/22.5计算，所得数值即为胰岛素抵抗指数。

1.5.4.4 肝脏病理（光镜） 光镜：肝脏组织常规石蜡包埋，5 μm厚连续切片，常规HE染色，光学显微镜下观察肝脏组织形态学改变。评估肝脂肪变性的程度，判断标准按照文献[5]脂变细胞占肝细胞的百分比进行脂变程度分级（表1）。

表1 肝细胞脂肪变性程度判断标准

1.6 统计学处理

数据采用SPSS 13.0 for Windows统计软件分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实验结束时各组大鼠剩余9～12只不等。

2.1 各组大鼠血清ALT、AST检测结果的比较

其余各组与模型组的ALT、AST水平差异有统计学意义（P<0.01）；除消低组外，其余各组与东宝组的ALT、AST水平差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）（表2）。

表2 各组大鼠血清ALT、AST检测结果的比较（U/L，x±s）

与模型组比较，*P<0.01；与东宝组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.2 各组大鼠血清TG、TC检测结果的比较

其余各组与模型组的TG、TC检测结果差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；模型组、消高组与东宝组的TG检测结果差异有统计学意义（P<0.01），空白组、模型组、消高组与东宝组的TC检测结果差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）（表3）。

表3 各组大鼠血清TG、TC检测结果的比较（mmol/L，x±s）

与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与东宝组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.3 各组大鼠血清瘦素、胰岛素抵抗指数检测结果的比较

除消低组外，其余各组与模型组的瘦素水平差异有统计学意义，除消低组、东宝组外，其余各组与模型组的胰岛素抵抗指数差异有统计学意义（P<0.01）；除

消低组外，其余各组与东宝组的瘦素水平差异有统计学意义，空白组、消中组与东宝组的胰岛素抵抗指数差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）（表4）。

表4 各组大鼠血清瘦素、胰岛素抵抗指数检测结果的比较（x±s）

与模型组比较，*P<0.01，与东宝组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.4 各组大鼠肝组织病理学变化

空白组大鼠肝组织形态学基本正常，模型组大鼠肝细胞以中、重度脂变为主，各治疗组大鼠肝脂变不同程度减轻，尤以消高组最轻，消中和东宝组次之，消低组又次之。消高组大鼠肝细胞以轻度脂变为主，大部分肝细胞结构已恢复，接近正常，少数细胞胞质内可见细小脂滴存在；消中组大鼠肝细胞以轻、中度脂变为主，中央静脉周围的肝细胞有所修复；消低组大鼠肝细胞以中、重度脂变为主；东宝组大鼠肝细胞轻、中、重度脂变均存在（表5）。

表5 各组大鼠肝细胞脂肪变性程度的比较（n）

与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与东宝组比较，#P<0.01

3 讨论

NAFLD的发病机制尚未明确，近年来，研究显示胰岛素抵抗和瘦素水平升高是影响该病病变程度的主要因素[6]，胰岛素抵抗是指外周组织对胰岛素的敏感性及反应性降低，胰岛素的生物学效应下降，胰岛素抵抗是2型糖尿病、肥胖、高血压、脂代谢紊乱、冠心病等多种疾病的共同发病基础[7]，其在脂肪肝的发生、发展中起重要作用[8-10]，其严重程度与NAFLD的病情进展及预后也有关系[11]，而瘦素抵抗在脂肪肝的形成中也有重要作用[12]，脂肪肝患者的血浆瘦素水平明显高于对照组，表明瘦素是脂肪肝发生的危险因素[13]，高水平的瘦素可引起并加重胰岛素抵抗，胰岛素抵抗和瘦素抵抗可能互为因果[14]，且瘦素还可介导T细胞免疫导致肝脏炎症反应，刺激肝星状细胞激活，从而促进纤维化发展[15-17]，因此，改善胰岛素抵抗和降低瘦素水平是防治脂肪肝的重要环节。

导师赵文霞教授认为，脂肪肝发生的常见原因或过食肥甘厚味，或情志失调，或感受湿热疫毒，或久病体虚等，导致肝失疏泄，脾失健运，湿热内蕴，痰浊内结，瘀血阻滞，而最终形成气、血、痰、瘀相互搏结，痹阻肝络。导师强调本病为因虚致实，认为[18]：“湿浊内停、瘀血阻络、肝失条达是本病的主要病机，而气虚是病理基础”，强调正气亏损尤其是脾气虚弱在本病发生、发展中的重要地位。本病属本虚标实，以标实为主，故在治疗中以化痰、活血为主，佐以疏肝、益气、健脾。导师研制的“消脂护肝胶囊”即宗此法，其由泽泻、山楂、黄芪、草决明等组成，具有祛湿化痰、活血化瘀、疏肝健脾的功效。方中泽泻，甘淡，性寒，归肾、膀胱经，功专利水降浊，泄热渗湿。《本草纲目》谓之能“渗湿热、行痰饮”，切重本病湿痰郁积的病机，故为君药；山楂，味酸甘，性微温，归脾、胃经，具有消食积、化瘀滞之功效。《本草纲目》谓之能“化饮食、消肉积、痰饮、滞血痛胀”（然油腻肉食正是引起脂肪肝的主要因素之一）；《医学衷中参西录》言：“山楂，若以甘药佐之，化瘀血而不伤新血，开郁气而不伤正气，其性尤和平也”。赤芍，苦，寒，归肝经，具有清热凉血，散瘀止痛之功效，《滇南本草》曰：赤芍“泻脾火，降气，行血，破瘀，散血块，止腹痛，攻疮痈”；二药配伍，消食化滞、活血化瘀、凉血活血，助君消散食、滞、瘀、热，故为臣药；黄芪，甘，温，归脾、肺经，具有补益中气、升发清阳之功效，《珍珠囊》谓之能“益元气、壮脾胃”，实为治本之要药。草决明，甘、苦，微寒，归肝、大肠经，具有清肝明目、润畅通便之功，使痰湿从二便分消，助君药祛湿化痰、凉血活血故为佐药；肝为风木之脏，主疏泄而喜条达，痰湿血瘀，结聚于肝，必致肝气郁结，故方选柴胡，辛、苦，微寒，归肝、胆经，取其疏肝解郁，条达肝气之功，引诸药归于肝经，直达病所，故为使药。诸药合用，共奏祛湿化痰、活血化瘀、疏肝健脾之效，标本兼顾，相得益彰。方中药物的现代研究进一步诠释了该方治疗脂肪肝的作用机制，泽泻提取物对各种原因所致的脂肪肝模型均有抑制作用，降低TG水平的作用显著，有良好的降血脂作用[16]；山楂提取物能使动脉粥样硬化兔血中卵磷脂比例提高，胆固醇和脂质在器官上的沉积降低。豚鼠服用山楂水煎剂后，对胆固醇合成酶活力有抑制作用，可使其肝细胞微粒体及小肠黏膜均浆羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）活力分别下降70%和67%左右[19]；决明子具有降压、降血脂及利尿作用，单味决明子糖浆治疗高脂血症，可显著降低胆固醇、脂蛋白及TG水平[20]。经过多层次深入的临床与本实验研究表明，该药能抑制TG、TC的合成，影响脂质的分布、转运与清除，改善脂质代谢；能保护肝细胞，减轻炎症反应，改善肝功能；该药还能明显降低血清瘦素水平并改善胰岛素抵抗，并可动员或减少肝脏脂肪沉积，对治疗脂肪肝有确切效果。

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（收稿日期：2015-06-13 本文编辑：许俊琴）