灯盏细辛活血化瘀成分筛选
时间：2021-04-23 08:00:25 来源：达达文档网 本文已影响 人 
摘要：中药活性成分的寻找和确定一直是中药药理学和中药化学研究的重点内容。本文根据中药化学成分与生物大分子发生亲和反应产生药理效应的原理，从数学角度提出寻找活性成分的方法。通过计算亲和常数来衡量各化学成分的亲和力，亲和力较大者为可能的活性成分。随后以灯盏细辛为例初步说明本方法应用的可行性，并发现8个峰（成分）是作用于血小板可能的成分，其中7号峰被指认为isochlorogenic acid B。本法的应用有望为中药活性成分的寻找提供新的策略。
关键词：活性成分 亲和力 指纹图谱 HPLC 灯盏细辛
中药（包括其复方）的作用具有多成分、多靶点、多途径的特征。针对此特征，"用"活性成分谱"思路破解中药的安全性和有效性"一文[1]相对完整地提出了中药活性成分谱的思想，也基于亲和原理对中药活性成分谱提出了理论性探索方法。本文试图从实践的角度探讨此问题的解决方式。由于中药的有效性是化学成分决定的，因此先从单一化学成分的作用方式进行分析。
1 单一活性成分作用的方式
中药作用的本质是化学成分与机体生物大分子相互作用的结果，作用的方式是通过亲和现象实现的。因此，某一活性分子的作用可以通过类似化学反应的方式来反映，相互作用达到平衡后则有反应式1和公式1。
（D表示游离状态药物分子，R表示未被结合的生物大分子，DR表示药物分子-生物大分子复合物，E表示效应）
KD表示解离常数，此处的单位是摩尔浓度，越小表示对形成复合物越有利。
公式2是分析化学药物与某一具体生物大分子相互作用产生药理效应的基础公式，适用于药物分子与受体、酶等生物大分子进行的反应，其中KD值越小表示此化学成分与靶分子的亲和力越强。实际上，公式2是米-孟方程（Michaelis-Menten Equation）的基础公式，在此也是我们分析中药活性成分的基础公式。
2 中药化学成分的检测
先假定提取到的中药成分都是可能的活性成分，因此中药提取物的成分可以采用HPLC指纹图谱的方式来反映，一个峰大体相当于一个化学成分，峰高（或峰面积）的大小则反映该成分的含量（浓度）。
3 理论求解
3.1 必要的假设 由于中药作用于机体的具体生物大分子尚未完全清楚，在采用公式2进行求解之前，为了简化问题，特提出必要的假设：①各中药成分之间无明显的相互作用；②各成分在与各自的靶分子相互作用时，无明显的竞争抑制作用；③化学成分与靶分子的亲和是双分子反应，不需要其它分子的介入；④只考虑各成分的直接作用，不考虑其代谢物可能参与的作用。
3.2 绝对求解 为了方便求解，可以将公式2进行变换得公式3和公式4。
公式3就是米-孟方程的双倒数变换（Lineweaver-Burk变换），而公式4就是Hanes变换。
为了求出[D]和[DR]，可以将不同浓度的中药提取物与同一可能的靶细胞（组织、器官）匀浆液充分相互作用，然后通过指纹图谱检测出[D]（游离药物）和[DT]（药物总量），随后根据公式5求出[DR]。也可以通过特殊方法直接检测[D]和[DR]。
[DR]=[DT]-[D]（公式5）
当获得[DR]和[D]后，即可以根据公式3或公式4作图计算出KD和[RT]。KD和[RT]是两个重要的常数，其中KD反映某一中药成分与靶分子间的亲和力，越小表示此成分与生物大分子的亲和力越强；[RT]是反映可能靶分子多少的参考值，值越大表明可能的靶分子越多。一般来讲，KD较小的成分活性较强，值得关注。
在实际工作中，根据公式3和公式4求KD和RT要求至少用2个不同浓度的提取物进行至少2次有效的亲和实验（最好3次以上），这样求的KD和RT较为可靠。然而绝对求解的前提是必须知道各指纹峰的分子量并能转化为真实的摩尔浓度。这一点有时很难做到，因此可以进行相对简化的求解，即KD`和[RT]`。
3.3 相对的简化求解 必须指出的是，公式3和公式4中的各分子浓度必须使用摩尔浓度，才能求得KD和[RT]的真实值；由于很多指纹峰很难直接指认，在筛选活性成分时更不可能知道其分子量（W）信息和交换因子（f）信息，这时可以用峰高（或峰面积）代入公式3或公式4进行计算，但求得的KD和[RT]会改变，对结果影响分析如下。
游离药物[D]（摩尔浓度）、药物总浓度[DT]和结合浓度[DR]与峰面积分子量存在公式6、公式7和公式8关系。
D为药物的游离浓度，Ai表示某峰亲和反应平衡后测得的峰面积，f表示交换因子，W表示分子量
DT为药物的总浓度，包括游离和结合；AT表示此峰未发生亲和测得的峰面积，f和W的意义同公式6
Ai、AT、f和W的意义同公式6～7
将公式8代入[RT]=[R]+[DR]得公式9。
将相应公式6～9代入公式1可以看出，因[RT]改变，KD也在改变。
因此，用峰高或峰面积求得KD实际上是调整后的KD，表示为KD`，相应的[RT]为[RT]`。从以上公式可以看出，调整后的KD`和[RT]`与f和W存在一定的函数关系。
这时KD`和[RT]`对活性成分或某一成分靶组织（细胞）的判断产生的影响有以下两种情况：①如果在相同靶组织（细胞）进行亲和以判断活性成分，存在一定的误差，误差大小与不同峰的f和W有关。②如果考察某个峰与不同靶组织（细胞）进行亲和判断其最可能的靶组织（细胞），则误差抵消。
在相对的简化求解过程中，为了扣除非特异性亲和带来的干扰，消除f和W的影响，可以设立空白亲和反应实验。即将中药提取物与非特异性蛋白质比如牛血清白蛋白（BSA）等也进行亲和反应，也求得相应的KD`和[RT]`。以此为参照，通过计算相对亲和力（Ac）和相对RT（RRT）指标，从理论上避免非特异性亲和干扰，消除f和W的影响，其计算公式参见公式10和公式11。
AC越小表示亲和力越大
RRT越大表示可能的靶分子越多
从公式10和公式11看出，由于采用相对值，因某些中药化学成分的未知f和W带来的误差完全抵消。Ac小于1才有实际意义，且Ac越小表明亲和力越大；RRT越大表明可能的靶分子越多。
必须指出的是，Ac和RRT均为无量纲，采用Ac和RRT进行中药活性成分谱分析时，Ac是要优先考虑的。因为根据前面的假设，亲和力是作用的前提。
3.4 关于结合率 亲和力反映了化学成分与可能靶分子之间的结合情况，直观地来看，亲和力越大，相结合状态的化学成分也越多。因此可以根据结合率来简单反映亲和力大小，见公式12。
在公式3和公式4中，[DR]和[D]均是变量，因此公式12求出的结合率也会随提取物浓度及靶分子量的变化而变化，因此结合率不是常数。
分析如下：
根据公式1，则有公式13；再将公式13进行双倒数再变换则有公式14。
公式14反映了结合率与[R]存在函数关系。当[R]无穷大时（相当于反应体系药物浓度无限小），则结合率接近于常数1；而[R]无穷小时（相当于反应体系的药物浓度无限高），结合率趋向于常数0。
因此，结合率在衡量亲和力大小时只具有有限的参考意义，适用于某些特殊情况。比如，当中药成分的含量较低，游离药物或结合药物太少，检测误差较大，导致可靠的[D]和[DR]数据不够时，方可考虑使用结合率来进行活性的粗略判断。
4 灯盏细辛活血化瘀成分筛选
现以筛选灯盏细辛（Erigeron breviscapus （Vant.） Hand-Mazz）的活血化瘀活性成分谱为例来说明上述方法的应用。由于灯盏细辛注射液的成分较多且其活血化瘀疗效也得到了广大临床认可，研究也表明灯盏细辛含有不需要生物转化就能直接起作用的化学成分[5]，故本示例根据亲和力筛选灯盏细辛直接的活血化瘀成分。
根据目前的研究成果，活血化瘀的可能靶组织（细胞、分子）主要是血液系统，包括血液、红细胞、血小板、血浆成分等。因此将此中药成分提取后（采用灯盏细辛注射液，云南生物谷灯盏花药业有限公司，批号20090830）与兔血的全血、红细胞、血浆、血清、血小板进行亲和反应（以BSA为对照）。进行亲和反应时，固定生物样品的量，用梯度浓度的提取物与生物样品进行相互作用（4℃过夜），记录反应前的HPLC-UV指纹图谱（其峰面积相当于[DT]）。灯盏细辛注射液的指纹图谱参见图1，在当前条件下，各指纹峰的检测重复性较好（RSD<8%，n = 5）。反应后，将体系用超滤法去蛋白操作再获得去蛋白液的HPLC-UV指纹图谱（其峰面积相当于[D]）。[7]求出[DR]后，可以根据公式3可以计算出各峰的常数KD（KD`）和[RT]（[RT]`），并根据公式10和公式11求出相对亲和常数（Ac）和相对RT（RRT），结果分别见表1和表2。
A：灯盏细辛注射液指纹图谱；B：四个对照品的指纹图谱（均购自中国药品生物制品检定所）色谱条件（液相色谱仪：日本岛津公司 岛津LC-2010C；检测波长：330nm；柱温：35℃；色谱柱：Phenomenex luna 5μ C18；洗脱梯度：10% A （0 min），17.5% A （20 min），17.5% A （40 min），45% A （80 min） and 45% A （90 min），A=乙腈，B=1%甲酸）[8]
No.3为绿原酸（chlorogenic acid），No. 5为咖啡酸（caffeic acid），No. 7为isochlorogenic acid B，No. 10为灯盏乙素（scutellarin）。
表1结果表明，指纹峰中（见图1）的16个成分尚有部分Ac在当前条件下未能测出，但能够大体看出，灯盏细辛提取物对红细胞的相对亲和力均较小，而对血小板的亲和力较大。对四个已知化合物而言，No.7 （isochorogenic acid B）和No.3和对全血、血浆、血清和血小板用的Ac值均较小，提示此成分与血小板有较强的亲和力，可能具有较强的抗血小板活性。对照表2，No.7的血小板RRT较大，提示其作用靶点可能主要分布在血小板。实际上目前的文献也表明No.3[9， 10]和No.7具有较好的抗血小板活性[11]。No.10（灯盏乙素）具有较强的活血化瘀活性[12]，但在灯盏细辛注射液中含量较低，本研究仍未能计算其Ac值。而其No.3（caffeic acid）的血小板活性较弱，只有在较大剂量才显示出抗血小板活性。本研究计算的Ac和血小板活性大致相符。因此，根据表1和表2结果，本次筛选结果提示血小板是灯盏细辛活血化瘀作用的主要靶细胞，并筛选出8个峰是作用于血小板可能的成分，其中7号峰被指认为isochlorogenic acid B。
5 问题与展望
5.1 理论性问题 本文前述的4项假设与实际情况具有一定差距。中药化学成分较多，且很多化合物具有相似结构和相似的化学性质，这可能会在一定程度上干扰其它化学成分与靶分子的亲和。
另外，亲和力只是中药化学成分发挥药效的前提条件，亲和力参数KD、KD`及Ac均没有包含活性方向信息（比如对生物大分子的激活或抑制作用）。因此某个高亲和力化学成分是否最终具有药理活性还必须结合传统药理学模型进行生物活性验证。
5.2 技术性问题 从示例可以看出，本方法要求指纹图谱检测方法有较高的灵敏性和稳定性。由于条件限制，本示例采用的是HPLC-UV分析方法，灵敏度有限，导致许多Ac和RRT均未能求出。事实上，采用高灵敏度检测方法比如HPLC-MASS，图1中可辨认的指纹峰可达50多个[8]。除UV检测器外，尽管本实验检测条件与参考文献[8]相同或接近，却只能测出其中的16个峰。其次，在去除生物大分子的操作中，大分子是相对概念，彻底去除是相对的，因此在检测中可能还会带来干扰。
5.3 展望 采用亲和原理和指纹图谱技术来获取中药化学成分的活性信息是一个有益的尝试。这将为中药活性成分的研究提供新的思路，有望为指纹图谱和生物活性建立起有效的内在联系。
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编辑/王海静
