参附注射液中3种痕量成分乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的测定

打开文本图片集

[摘要]该文建立了参附注射液中3种痕量附子指标成分的含量测定方法，为评价君药附子的药效学作用提供了依据。样品经中空纤维液相微萃取（HF，LPME）进行纯化富集，采用ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流动相乙腈，10 mmol·L^-1碳酸氢铵溶液（pH 10），流速0.45 mL·min^-1，梯度洗脱。电喷雾电离（ESI）、多反应监测（MRM）方式进行含量测定。结果表明，乌头碱、次乌头碱、新乌头碱在0.1～100 ng·L^-1线性关系良好，r>0.999，检测限分别为0.03，0.03，0.02 ng·L^-1，平均加样回收率分别为100.1%，97.4%，97.5%，RSD分别为1.2%，1.1%，1.5%。该方法保证了参附注射液的用药安全，为正确评价附子的君药药效学作用提供了科学依据，为含有附子的中药制剂的质量控制提供了可靠方便而实用的检测手段。

[关键词]乌头碱；次乌头碱；新乌头碱；参附注射液；中空纤维液相微萃取；超高效液相色谱质谱

参附注射液源于古方“参附汤”，是以红参、附子为主要成分的中药注射液，具有回阳救逆、益气固脱的作用。临床上主要用于治疗心源性休克和心力衰竭。处方中，附子作为君药，其主要活性成分为乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等双酯型生物碱，现代药理学研究证实，这类生物碱具有抗炎、免疫抑制、麻醉止痛、抗肿瘤等作用^[1，2]，对心血管系统具有强心、降血压、扩血管等作用^[3]。但同时这类生物碱的毒性较强，主要损害循环系统及中枢神经系统，引起机体多脏器功能的损害^[4]。参附注射液在生产过程中，除对附子药材的炮制处理有严格的要求外，还需通过特有的水解转化等工艺降低其毒性^[5]，保证用药安全。所以，制剂质量标准及研究文献中研究人员都试图对附子中双酯型生物碱含量进行严格的控制^[6，7]。

但是，经过减毒处理工艺，双酯型生物碱在制剂中的含量极低，采用常规仪器分析检测时，由于仪器灵敏度的限制，其结果往往不能准确检测其含量^[8]，分析方法不能满足分析定量的要求，不能体现附子作为中药方剂中君药的药效学地位。为了保证用药安全同时更好地评价参附注射液的质量，保证方剂中君药的药效学作用，迫切需要建立高灵敏度的检测方法对其进行定量测定。

本试验建立了超高效液相色谱，质谱（UPLC，MS/MS）方法，采用中空纤维微萃取（HF，LPME）对制剂中痕量双酯型生物碱进行纯化富集，定量分析了制剂中3种乌头类生物碱含量。为保证用药安全同时正确评价参附注射液中附子的药效学作用提供了可靠的手段。

1 材料

超高效液相色谱系统（美国Waters）；UPLC BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） （Waters，Milford，MA，USA）；Xevo TQ，S三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾离子化源以及MassLynx V4.1数据处理软件（Waters，UK）；Milli，Q超纯水制造系统（Millipore，Billerica，MA，USA）；DF，Ⅱ集热式控温磁力搅拌器（金坊市富华仪器有限公司）；聚丙烯中空纤维，壁厚20 μm，外径400 μm，截留分子量6 000（杭州凯洁膜分离技术有限公司）。

乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、滇乌头碱对照品由中国食品药品检定研究院提供，纯度均大于99.5%；参附注射液（雅安三九药业有限公司，批号111004，110702，111001）。乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和质谱条件

UPLC BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相乙腈（A），10 mmol·L^-1碳酸氢铵溶液（pH 10），梯度洗脱，0 min，30%A，1～4 min，60%～70%A，4～4.25 min，70%～90%A，4.25～4.5 min，90%～30%A，4.5～5 min，30%A，流速0.45 mL·min^-1；进样量5 μL；柱温箱和样品室温度分别为35，4 ℃。

电喷雾离子源（ESI源），正离子模式，多反应监测（MRM）；毛细管电压3.5 kV；源温和去溶剂温度分别为150，500 ℃；锥孔、去溶剂气的流速分别为150，800 L·h^-1；被分析物的监测离子、锥孔电压、碰撞电压等参数见表1。

2.2 样品制备

精密称取乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对照品约10 mg分别置100 mL量瓶中，加乙腈使其溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品储备液。试验中用乙腈稀释至所需质量浓度。

精密量取参附注射液2 mL置10 mL安瓿瓶中，加重蒸水稀释至刻度，摇匀，即得参附注射液样品溶液。将中空纤维切成约8 cm的小段，放入重蒸馏水中超声清洗15 s，晾干、备用。将中空纤维浸泡于正辛醇中24 h。使用时，用空气将中空纤维中的正辛醇打出，用微量进样器精密加入0.01 mol·L^-1的HCl溶液50 μL。将2个注射用针头穿过橡皮塞插入已处理好的中空纤维中，并将其置入装有转子的10 mL安瓿瓶中。在搅拌速度800 r·min^-1，40 ℃条件下萃取40 min，取出中空纤维，擦拭外壁，用空气将内腔液接收相打出，收集，按1.2项下色谱条件进行检测。

2.3 系统适应性

在2.1项下色谱条件下，乌头碱、次乌头碱、新乌头碱混合对照品溶液和供试品溶液色谱图见图1。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取一定量3种乌头类生物碱对照品储备液，制备乌头碱、次乌头碱、新乌头碱混合对照品溶液，质量浓度为1 μg·L^-1，依次稀释得质量浓度分别为100，10，2.5，1，0.25，0.1 ng·L^-1。按2.2项下进行样品制备，并按2.1项下色谱条件进行检测，记录峰面积。以峰面积（y）对质量溶度（x）进行线性回归，乌头碱、新乌头碱、次乌头碱在0.1～100 ng·L^-1线性关系良好，回归方程分别为y=492.1x+122.3（r=0.999 2），y=355.9x+98.34（r=0.999 6），y=117.1x+218.3（r=0.999 2）。

2.4.2 精密度考察 按2.1项下色谱条件，取同一样品的萃取液连续进样5次，乌头碱、次乌头碱、新乌头碱峰面积的RSD分别为1.6%，2.9%，1.6%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性考察 准确量取同一批号的样品5份，按2.2项下方法制备供试品溶液，进行测定，记录色谱图以及各成分峰面积计算含量，乌头碱和次乌头碱含量的RSD分别为1.1%，3.8%。

2.4.4 加样回收率试验 精密量取已测定含量的参附注射液样品（批号111004）2 mL，共5份，每份分别准确加入200 ng·L^-1乌头碱、5 μg·L^-1次乌头碱、5 μg·L^-1新乌头碱溶液各100 μL，按2.2项下方法制备溶液，进行测定，结果见表2。

2.4.5 检测限和定量限 根据信噪比S/N=3和S/N=10确定目标物的最低检测限和定量限，乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的检测限分别为0.03，0.03，0.02 ng·L^-1；定量限分别为0.1，0.1，0.05 g·L^-1。

2.5 样品测定

按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下条件进行测定，计算乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的含量，结果见表3。对3批参附注射液中3种乌头类生物碱进行了检查，新乌头碱均未检出。

3 讨论

3.1 检测方法与提取方法的选择

近年来有关参附注射液的试验研究及临床应用的报道较多^[8，10]，证明参附注射液对中枢神经系统、循环系统、呼吸系统、肾脏、肠道、血液系统、免疫系统等均有保护作用，是临床上常备的急症用药之一。其中附子中含有的双酯型生物碱是重要的毒效成分，既具有较强的毒性，又是主要的活性成分，其含量直接影响用药的安全性和有效性，所以，需要对其进行定量测定。

目前，关于参附注射液中乌头类生物碱的检测方法包括薄层色谱法^[5]和HPLC，UV法^[8]。文献[8]建立了HPLC法，同时分离了上述3种生物碱，检测限为50，100，50 μg·L^-1。此法对乌头类生物碱进行了限量检查，保证了用药安全，但由于受仪器灵敏度的限制，未能对其进行定量测定，不能更好地体现方剂中附子的君药药效学作用，因此，需要建立高灵敏度的检测方法对其进行定量测定。

本试验采用UPLC，MS/MS法进行检测，若采用直接进样，得到乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的定测限分别为10，25，25 ng·L^-1，较之前方法检测灵敏度显著提高了，但仍未检出3种双酯型生物碱，这就需要采用具有富集效果的前处理方法，对制剂中痕量双酯型生物碱进行纯化富集，进一步提高检测灵敏度。

HF，LPME是较为常用的富集效率高的前处理方法，已广泛应用于生物样品中生物碱的测定，但对液体制剂中生物碱的测定未见报道。该法克服了传统液液萃取技术繁琐、浪费、污染等缺点，装置简单，有机溶剂用量少，集提取、纯化、富集于一体，特别适合于分析复杂样品中微量及痕量物质^[11]。同时中空纤维膜是一次性使用的，可以避免交叉污染^[12]。因此，本试验采用HF，LPME对样品进行前处理。结果表明，用HF，LPME法对样品进行富集，3种乌头类生物碱的富集倍数分别为109，290，138倍，定量限达到了0.1，0.1，0.05 ng·L^-1，大大提高了方法的检测灵敏度，定量分析了制剂中3种乌头类生物碱含量。

3.2 HF，LPME条件的优化

3.2.1 给出相和接收相pH的优化 在三相体系中，给出相和接收相的pH对萃取结果影响很大，调节给出相（样品溶液）的pH使分析物呈分子状态，降低其水溶性，容易被有机溶剂萃取；调节接收相的pH使分析物呈离子状态，可提高接收相（中空纤维内液）对有机相中萃取的待测物的反萃取能力^[13]。

乌头碱、次乌头碱、新乌头碱为生物碱，萃取应在碱性条件下进行，而反萃取应在酸性条件下进行。因此，本试验调节给出相和接收相溶液的pH，考察了pH 10～13对萃取情况的影响，以及pH 1～3对反萃取情况的影响，结果显示，当给出相pH为11时萃取效率最高，同时当接收相pH为2时反萃取效率最高。

3.2.2 萃取时间的考察 萃取是动态的传质平衡过程，萃取效率与时间长短有关。适当延长萃取时间，可以获得较高的回收率，但时间不能太长，否则接受相溶剂会有明显损失，萃取效率反而降低，分析速度减慢^[14]。本试验分别考察了萃取20，40，50，60，80，100 min对萃取效率的影响，结果表明，萃取时间为40 min时，萃取效率最大，随着萃取时间的继续增加，大于1 h时萃取效率下降。综合考虑，最终选择萃取40 min。

3.2.3 萃取温度的考察 温度是影响萃取的重要因素，高温能够促进待测组分的传质速率，但温度过高，又促进了有机相的挥发，对萃取产生不利的影响，且乌头碱和次乌头碱对热不稳定。本试验考察了萃取温度30，40，50，60 ℃对萃取效果的影响。结果显示，当温度为40 ℃时，峰面积最大，温度继续升高，峰面积反而减小。因此，本试验选择40 ℃为最适萃取温度。

3.2.4 搅拌速度的考察 增加搅拌速度便于目标分析物的传质扩散，可提高萃取速度，缩短萃取时间。但速度不宜太快，太快容易造成中空纤维壁上有机相的脱落，且易形成空气泡附着在中空纤维的表面阻碍物质的传递^[14]。本试验分别考察了400，600，800，1 000 r·min^-1对萃取效率的影响，结果表明搅拌速率为800 r·min^-1时萃取效率最高，因此选择800 r·min^-1为最终搅拌速率。

3.2.5 给出相盐浓度的考察 增加给出相盐（NaCl）浓度，可以增加离子强度，使待测组分的溶解度减小，从而有利于从给出相水相中被萃取到中空纤维膜的有机相中。本试验分别考察了NaCl的质量分数为0，5%，10%，20%，30%时对萃取效果的影响。结果表明，随着盐浓度的变化，萃取效率并未改变。同时考虑到电解质的存在也有可能改变中空纤维膜的物理特性^[15]，故本试验不添加NaCl。

3.2.6 富集倍数的考察 HF，LPME最大的优点就是富集倍数（eichment factor，EF）高，能够实现对样品中微量或者痕量组分的定量分析。EF=100Sa/Sb，Sa是稀释100倍后分析物经HF，LPME富集后进样的峰面积，Sb未经稀释直接进样的峰面积，本试验在优化条件下，乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的富集倍数分别为109，290，138倍。

4 结论

本试验建立了UPLC，MS/MS方法，采用HF，LPME对制剂中痕量双酯型生物碱进行纯化富集，定量分析了制剂中3种乌头类生物碱含量。实现了HF，LPME离线富集技术与UPLC，MS/MS的联合，同时将HF，LPME高效、富集倍数高的优点与UPLC，MS/MS快速、灵敏度高等优点进行结合，大大提高了检测灵敏度，同时完成了对3种双酯型生物碱的快速检测，保证了参附注射液的用药安全，为正确评价附子的君药药效学作用提供了科学依据，为含有痕量毒性成分中药制剂的生产及质量控制提供了可靠、方便、实用的检测手段。

[参考文献]

[1] 中华人民共和国卫生部药政管理局. 现代实用本草（上册）[M]. 北京：人民卫生出版社， 1997：5， 496， 519.

[2] 沈映君. 中药药理学[M]. 北京：人民卫生出版社， 2000：382， 490.

[3] 符华林. 我国乌头属药用植物的研究概况[J]. 中药材， 2010， 27（2）：149.

[4] 张宏顺. 乌头类重要的毒性及中毒处理[J]. 药物不良反应杂志， 2005（5）：114.

[5] 续海训， 徐康雅. 参附注射液中附子成分分析[J]. 中医杂志， 2003， 44（9）：677.

[6] 侯秀娟， 章鹏， 马菲， 等. 对附子临床应用安全性的思考[J]. 北京中医药， 2011， 30（3）：218.

[7] 聂黎行， 张聿梅， 鲁静， 等. 附子和附片质量标准研究[J]. 中国药学杂志， 2010， 45（15）：1182.

[8] 刘秀秀， 晁若冰. HPLC控制参附注射液及附子中3种双酯型生物碱[J]. 中国中药杂志， 2007， 32（2）：153.

[9] 黄芳， 徐宏彬. 参附注射液治疗心力衰竭的系统评价[J]. 中国医院药学杂志， 2011， 31（13）：1103.

[10] 杨倩春， 毛炜， 刘旭生， 等. 参附注射液治疗心源性休克有效性和安全性系统评价[J].中华中医药杂志， 2012， 27（4）：1052.

[11] 张波， 苏奉发， 罗富莲. 液相微萃取及其在生物样品分析中的应用[J]. 川北医学院学报， 2010， 25（1）：70.

[12] 马文涛， 勒健， 洪战英， 等. 液相萃取技术在药物分析中的应用及研究进展[J]. 中国药学杂志， 2010， 45（6）：404.

[13] 杨新磊， 罗明标， 丁健桦， 等. 液相萃取技术在生物样品药物检测中的应用[J]. 药物分析， 2007， 27（12）：1998.

[14] 刘敏， 刘彦， 蒋晔. 中空纤维液相微萃取，高效液相色谱连用分析牛奶中痕量雌二醇[J].中国卫生检验杂志， 2011， 21（6）：1379.

[15] Pan H J， Ho W H. Determination of fungicides in water using liquid phase microextraction and gas chromatography with electron capture detection[J]. Anal Chin Acta， 2004， 527（1）：61.

Determination of aconitine， hypaconitine and mesaconitine in Shenfu injection

ZHANG Pan，pan^{1， ZHANG Jun，zhen2， WANG Zhao，hong3， LU Yong，jiang4， JIANG Ye1*}

（1.School of Pharmacology， Hebei Medical University， Shijiazhuang 050017， China；

2. The Fourth Clinical Medical College of Hebei Medical University， Shijiazhuang 050011， China；

3. Institute of Forensic Science of Supreme People′s Procuratorate， Beijing 100040， China；

4. Juxian County Hospital of Traditional Chinese Medicine， Rizhao 276500， China）

[Abstract]To establish a method for the content determination of indexes for measuring aconitic compounds contained in Shenfu injection， in order to provide basis for the evaluation of the curative effect of monkshood in Shenfu injection. The sample were purified and eiched with HF，LPME. ACQUITY UPLC BEH C₁₈ column （2.1 mm×50 mm， 1.7 μm） was adopted and eluted with a gradient program， with acetonitrile，10 mmol·L^-1 NH₄HCO₃ （pH 10） as the mobile phases. The flow rate was 0.45 mL·min^-1. The content was determined with ESI and MRM. The results showed that aconitine， hypaconitine and mesaconitine showed a good linear relationship， with r>0.999， within the range of 0.1，100 ng·L^-1. The recoveries were detected to be 100.1%， 97.4%， 97.5%， with RSD being 1.2%， 1.1%， 1.5%， respectively. This method was used to prove the safety of Shenfu injection， and provide scientific basis for correct evaluation of curative effect of monkshood， as well as a reliable， simple and practical means for quality control of monkshood，containing Chinese materia medica preparations.

[Key words]aconitine； hypaconitine； mesaconitine； Shenfu injection； HF，LPME； UPLC，MS/MS

doi：10.4268/cjcmm20131013