单核细胞增生李斯特菌 不同方法检测食品中单核细胞增生李斯特菌比较
时间：2019-01-15 04:44:03 来源：达达文档网 本文已影响 人 
单核细胞增生李斯特菌广泛分布于自然界，污染肉禽类、乳类、鱼贝类及蔬菜等食品引发食物中毒。新生儿、高龄孕妇和免疫力低下者易感染，主要引起脑膜炎和败血症，死亡率较高。美国、英国、加拿大等国多次爆发由该菌污染空心菜、奶酪等引起食物中毒，病死率达30％以上。�
一般基层单位主要采用国家标准检测食品中单核细胞增生李斯特菌，常规检测流程从分离、培养、鉴定都沿用传统方法，需要6～7 d甚至更长，菌落形态识别难，受主观人为因素影响大，阳性率低。近年来发展出新型显色平板、API生化鉴定试剂及PCR技术等快速检测方法，提供了更快捷高效的检测手段。为探索更优化的单核细胞增生李斯特菌检测方法，我们对从区内食品污染物监测点采集6类361件食品样品，选用3种方法检测单核细胞增生李斯特菌，并对这几种方法进行比较。��
1 材料与方法�
1.1 标本来源�
从区内集贸菜场、大中型超市采集各类食品，包括生畜禽肉、熟肉制品、豆制品、水产品、速冻米面制品、生食蔬菜共6大类361件样品。�
1.2 培养基和试剂�
李氏增菌肉汤、TSA-YE琼脂、EB增菌液，MMA琼脂、SIM动力培养基、血琼脂、各种糖发酵培养基等均为上海市疾病预防控制中心提供的干粉制品，使用时按说明书配制而成。李斯特菌显色平板为科玛嘉公司生产的成品。API Listeria 10300生化鉴定试剂盒由法国梅里埃公司生产。PCR试剂盒由佳宁科技公司生产。以上培养基和试剂均在有效期内使用。�
1.3 检验方法�
1.3.1 食品微生物检验（方法1） 按照食品卫生微生物学检验GB/T4789.31―2003的方法，取检样25 g打碎，加入225 mL LB1增菌液混匀，于30℃环境培养24 h，吸出0.1 mL加入10 mL LB2增菌液中，再于30℃环境培养24 h。分离MMA平板,于30℃环境培养48 h,挑5～6个可疑菌落接种三糖铁琼脂和SIM动力培养基。选择三糖铁琼脂上、下层产酸、动力呈伞状者在TSA-YE平板上纯培养，进一步作染色镜检、溶血试验和各种传统生化试验。�
1.3.2 食品污染监测（方法2） 按照上海市食品污染物监测方案的方法，2次增菌后，分离科玛嘉李斯特菌显色平板，于36℃环境培养24 h，挑5～6个可疑菌落接种木糖、鼠李糖，同时在TSA-YE平板上纯培养。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物进一步作染色镜检、生化试验等，生化试验用API Listeria 10300生化鉴定试剂盒。�
1.3.3 PCR筛选法（方法3） 对LB2增菌液用美国Opticon2荧光定量PCR系统进行单核细胞增生李斯特菌筛选，阳性者按1.3.2方法分离科玛嘉李斯特菌显色平板后培养验证。��
2 结果�
2.1 不同方法检测结果�
方法1检测361件样品，其中2件检出单核细胞增生李斯特菌（生畜禽肉1件，速冻米面制品1件），阳性率为0.55％。方法2检测361件样品，其中9件检出单核细胞增生李斯特菌（生畜禽肉7件，速冻米面制品2件），阳性率为2.49％。方法3检测经Opticon 2荧光定量PCR系统从LB2增菌液筛选出11件阳性样品，将其分离科玛嘉李斯特菌显色平板，挑可疑菌落经染色镜检、生化试验等证实为单核细胞增生李斯特菌阳性的有10件（生畜禽肉8件，速冻米面制品2件），阳性率为2.77％。�
2.2 方法2与方法1比较�
方法1检测单核细胞增生李斯特菌阳性率为0.55%；方法2检测单核细胞增生李斯特菌阳性率为2.49%。两种方法均检出阳性样品2件，两种方法均为阴性的352件，方法2阳性而方法1阴性的有7件，见表1。经统计分析，两者阳性率差异有统计学意义(χ2=5.14，P2=6.13，P0.5)。 ��
3 讨论�
单核细胞增生李斯特菌是一种重要的食源性致病菌，在国外食品中的污染率达5％～30％，感染后病死率高达30％～70%。在世界范围内确认的爆发事件近20起，引起爆发的食物有蔬菜、奶酪、肉制品和熏制的海产品等。2008年8月加拿大发生李斯特菌食物中毒事件，污染源为枫叶公司生产的熟肉食品，造成10多人死亡。我国虽未有爆发性流行，但也加强了食品中单核细胞增生李斯特菌的污染调查，可是往往传统的检测手段耗时耗力、漏检误检，造成阳性率偏低。�
本组资料中361件样品选用3种检验方法进行平行检测，相比之下国标法（GB/T4789.31-2003）检测单核细胞增生李斯特菌的阳性率较低，其它2种方法有助于提高阳性率。国标法中MMA平板菌落形态视觉上很难辨别，且只能确定可疑菌落为李斯特菌属,然后再通过一定的生化试验检出单核细胞增生李斯特菌，而溶血试验的结果判读受主观因素影响较大。科玛嘉李斯特菌显色平板上杂菌少，单核细胞增生李斯特菌菌落为蓝色带白色晕圈，特征明显，容易识别，很大程度上减少了人为影响。居建华等统计显示，可疑菌落的确定概率>95%，是MMA平板的3倍多。生化鉴定时用APL listeria 10300生化鉴定试剂盒与传统生化管相比，时间仅需1 d，也很容易掌握。PCR技术的发展已经相当成熟，并且已应用于单核细胞增生李斯特菌的检测。方法1中的2件阳性样品和方法2中的9件阳性样品经pticon 2荧光定量PCR系统筛选均为阳性，用常规培养法验证，结果全都分离到单核细胞增生李斯特菌，方法3与方法2虽然在阳性率上无差异，但提高了工作效率，表明PCR检测方法快捷可靠。常规法检测至少需要7 d，PCR法可在几个小时内得出初筛结果，有利于食品污染的监测和食物中毒事件的快速反应。�
方法3中经PCR系统筛选阳性的11件样品，经常规培养鉴定有1件未检出，分析原因有2种可能：①菌已死亡，因为PCR检测的是核酸而非活菌。②样品中单核细胞增生李斯特菌含量很低，PCR方法灵敏度高能检测到，而在平板上未能分离到。�
实验证明，科玛嘉李斯特菌显色平板及PCR技术具有较高的灵敏度和特异度，较低的假阳性率和假阴性率，无疑为准确、快速检测提供了新的选择，特别是样品量较大时，更加显示其优势。对大量样品进行筛检时，建议可以先多个样品合并一组用PCR技术进行初筛，结果阳性者再对该组逐个作科玛嘉李斯特菌显色平板分离培养，挑可疑菌落接种纯分离TSA-YE平板，再转种SIM动力管、点种血琼脂平板，凡符合25℃时呈伞状动力、血平板上菌落有狭小透明溶血环者，用APL listeria 10300生化鉴定试剂盒作生化鉴定。这样就缩短了检验周期，提高了工作效率（减少了许多平板分离、形态识别及生化试验工作量），同时多种手段相结合，避免了漏检、误检，提高了阳性检出率，能较快得出正确结果。�
由于方法2与方法3中单核细胞增生李斯特菌阳性检出率比较接近，样本量（361件样品）又较小，难于对其检测效果进行评价，有待以后扩大样本含量作进一步探讨。��
4 参考文献�
［1］王捷.李斯特菌食物中毒\.现代预防医学，1999，26：550-552.�
［2］吴蜀豫，李迎惠，冉陆，等.中国2001年11省（市）食品中李斯特菌污染状况的主动监测\.中华流行病学杂志,2003,24(8):657-659.�
［3］居建华，叶虹，顾伟忠，等.应用不同培养基检测单增李斯特菌结果比较\.上海预防医学，2008，20（1）：32-33.�
［4］何浩，吴永生，于霞.产单核细胞增生性李斯特菌研究现状\.肉品卫生，2003，7:9-16.�
(收稿日期：2009-02-09)
