温补肾阳药对肾上腺切除的肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组的影响 肾阳亏虚怎么调理

　　摘要：目的：应用凝胶内差异显示电泳技术和质谱技术研究温补肾阳药对肾上腺切除的肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组的影响。方法：通过切除两侧肾上腺造成肾阳虚模型大鼠和温补肾阳药治疗大鼠肝线粒体蛋白质经荧光染料Cy3、Cy5标记，与等量Cy2标记的内标混合后在同一胶中进行电泳分离，经不同光激发后扫描得到不同样品的蛋白质组图谱。利用DeCyder软件进行差异蛋白质组分析，筛选出18个差异蛋白质进行质谱鉴定，其中15个蛋白质得到鉴定。结果：经温补肾阳药治疗后，肾阳虚动物氨甲酰磷酸合成酶、过氧化氢酶、二氢硫辛酸脱氢酶、热休克蛋白60、亚硫酸氧化酶、ATP合成酶、醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、3-巯基丙酮酸转硫酶、腺苷酸激酶同工酶5、谷胱甘肽过氧化物酶表达均增高。结论：温补肾阳药可能通过加快糖、脂类、蛋白质和核酸分解代谢，加快ATP合成以及清除自由基和过氧化物，维持线粒体膜稳定性，从而起到治疗肾阳虚的作用。
　　关键词：肾阳虚；线粒体；蛋白质组；温补肾阳药
　　中图分类号：R2-031；Q493.8 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)04-0744-04
　　
　　肾阳虚证是指由于肾阳虚衰，温煦失职，气化失权所表现的一类虚寒证候。许多学者认为肾阳虚与神经－内分泌紊乱有关，肾阳虚病人垂体-肾上腺皮质功能降低和垂体-甲状腺功能降低[1-2]，临床主要表现为腰膝酸软、畏寒肢冷、头晕目眩、精神萎靡、面色白、舌淡苔白和脉沉细等。临床上用温肾助阳药治疗后可改善脾肾阳虚症状，使基础代谢升高。本实验采用两侧切除肾上腺方法造成肾阳虚模型大鼠，利用凝胶内差异显示电泳技术（differential in-gel electrophoresis，DIGE）和质谱技术，建立肾阳虚模型大鼠及温补肾阳药治疗组大鼠肝线粒体双向电泳图谱，并进行差异蛋白质组分析，从蛋白质表达水平上以动态的、整体的角度阐述中医温补肾阳药作用的分子基础，最终指导中医临床治疗。
　　
　　1实验材料
　　
　　1.1温补肾阳药仙茅10g，淫羊藿10g，肉苁蓉15g，附子6g，干姜6g，由浙江省中医院中药房提供，常规水煎2次，合并煎液，浓缩至0.8g/mL,冰箱内保存待用。
　　1.2实验动物8只SD大鼠，体重（280±20）g，购自浙江中医药大学实验动物中心，随机分为2组（模型组和治疗组），每组4只，于室温下饲养3天，控制空气干湿度，随意饮水和进食。经过适应期，切除大鼠两侧肾上腺，喂养6天后大鼠出现饮食明显减少、体重减轻、反应迟钝、拱背耸毛、毛色无光泽、有脱毛现象，大便稀溏等症状。从第7天开始，治疗组喂饲温补肾阳药煎剂2.5mL/只，连续6天，模型组喂饲同样量的生理盐水。
　　1.3主要的试剂丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、硫脲、甘氨酸、TRIS、CHAPS、SDS、碘乙酰氨、固相pH干胶条(IPG strip pH3-10,NL,24cm)，Ampholyte pH 3-10，2D clean up试剂盒，蛋白质定量试剂盒均为美国GE healthcare公司产品。所有溶液均用MilliQ水配制。
　　1.4主要仪器EttanTM IPGphorTM等电聚焦电泳仪，EttanTM DALTSix垂直板电泳仪，Typhoon 9400多功能荧光扫描成像系统，DeCyder Image QuantTM V5.0凝胶图像分析软件，均为GE healthcare公司产品。串联质谱仪（MALDI TOF-TOF 4800）为美国ABI公司产品，P80MX超速冷冻离心机为日本HITACHI公司产品。
　　
　　2研究方法
　　
　　2.1肝线粒体蛋白制备最后一次喂药后1h，断头处死动物，取肝脏用0.25mol/L蔗糖冲洗两次，在4℃ 1/10(w/v)体积pH 7.4的MSHE缓冲液(0.22mol/L甘露醇,0.07mol/L蔗糖, 0.5mmol/L EGTA,0.1%牛血清白蛋白,2mmol/L Hepes/KOH )中匀浆，600g离心5 min后取上清，再经10300g离心10min，沉淀物重悬于5mL MSHE，加到20mL含30% Percoll的纯化液中（225mmol/L甘露醇,1mmol/L EGTA,25mmol/L Hepes,0.1%牛血清白蛋白），于95000g离心30min，收集密度1.052-1.075g/mL之间的悬液，加入40mL MSHE，于6300g离心10min以去除Percoll。并用150mmol/L KCl和MSHE分别洗涤两次[3]，加入1mL裂解液（30mmol/L Tris, 8mol/L尿素,4% CHAPS，pH8.5），4℃孵育2h。置冰上超声，超声后用12000g离心30min，取上清用2-D clean up kit 去杂质，并用2-D定量试剂盒测定蛋白质浓度，分装成10μg/μL, 置-80℃保存。
　　2.2荧光标记蛋白质将CyDye (Cy2,Cy3,Cy5)从-20℃取出，室温放置10min，加入25μL二甲基甲酰胺，涡旋混匀，12000g离心30s，取出2μL配成200pmol/L的工作液，每个样品各取50μg蛋白质，调节pH至8.5，分别加入400pmol相应的染料，振荡混匀，冰上避光孵育30min，加入1μL 10mmol/L赖氨酸中止反应，剧烈振荡，冰上避光放置10min，加入2倍体积缓冲液（8mol/L尿素,130mmol/L DTT, 2% CHAPS，2% pH3-10的Pharmalyte），冰浴10min[4]。
　　2.3双向电泳模型组和治疗组各4个样品分别用荧光染料Cy3、Cy5标记，上述8个样品等量混合用Cy2标记作为内标，将Cy2、Cy3、Cy5的3个样品混合，用水化液(8mol/L尿素,2%CHAPS，13mmol/L DTT，0.5% IPG buffer,0.002%溴酚蓝)定容到450μL，制成第一向等电聚焦体系，采用胶内泡涨的方法上样，8个样品被加到4条pH3-10的非线性胶条中[5]。等电聚焦的参数：30V 12h；500V 1h；1000V 1h；8000V 8h。等电聚集后，胶条于平衡液1（1%DTT,50mmol/L Tris-HCl,6mol/L尿素,30%甘油,2%SDS,0.002%溴酚蓝）、平衡液2(4%碘乙酰氨,50mmol/L Tris-HCl,6mol/L尿素,30%甘油,2%SDS,0.002%溴酚蓝)中各平衡15min，然后转移到第二向已制好的12.5%SDS-PAGE胶上，用0.5%低溶点琼脂糖封顶，进行第二向电泳，电泳参数设定为：30W 45min；90W 6h。直到溴酚蓝染料迁移至胶的底部边缘，结束电泳。
　　2.4图像扫描分析荧光标记蛋白经凝胶电泳后用MilliQ纯水冲洗数次，在Typhon9400荧光扫描仪不同激发光下扫描成像，所用的滤光片和PTM电压如下：Cy2：Blue2(488)/600；Cy3：Green(530)/680；Cy5：Red(633)/590。所得的蛋白质组图谱用DeCyder Image QuantTM V5.0图像分析软件进行点识别、背景消除、点匹配及差异蛋白质分析。
　　2.5胶内酶解及质谱分析制作1块的制备胶，银染后切下感兴趣的蛋白质点，置于离心管中，用双蒸水冲洗后加入50μL脱色液［50mmol/L Na2S2O3,15mmol/L K3Fe(CN)6］脱色2min，双蒸水冲洗，去除溶液，再用100μL 25mmol/L NH4HCO3冲洗，剧烈振荡8min，去除液体后100μL乙腈脱水8min，迅速干燥，盖上含10nmol/L DTT的25mmol/L NH4HCO3 100μL，于57℃还原1h，室温冷却，去掉过量液体，迅速加入100μL 25mmol/L NH4HCO3（含55mM碘乙酰胺），室温放置1h，使蛋白质烷基化，反应后去除悬液，加少量100mmol/L NH4HCO3清洗两次，100μL纯乙腈脱水后加入等体积的100mmol/L NH4HCO3，冻干。估计干胶体积，加入3倍体积的12.5ng/μL胰蛋白酶（用25mmol/L NH4HCO3 配制），37℃酶解过夜，酶解后用50μL 45% H2O/5%TFA/50%乙腈萃取两次，合并萃取液冷冻干燥后由进行MALDI-TOF-TOF-MS检测，得到肽质量指纹图谱，通过Mascot数据搜索，结合2-D图谱上初步的蛋白质的分子量、等电点信息鉴定蛋白质[6]。
　　
　　3结果与分析
　　
　　3.1不同组大鼠肝线粒体蛋白质组图谱双向电泳结束后，每块SDS-PAGE胶用488、530和633nm 3种波长的激发光进行扫描，获得内标图谱，肾阳虚模型组大鼠肝线粒体蛋白质组图谱和治疗组大鼠肝线粒体蛋白质组图谱。图1是从Gel4中扫描得到的蛋白质组图谱，由左到右分别是内标图谱，模型组大鼠肝线粒体蛋白质组图谱和治疗组大鼠肝线粒体蛋白质组图谱。
　　
　　3.2差异蛋白质分析所有4块胶扫描所得的蛋白质组图谱用分析软件DeCyder5.0进行分析，Gel4中被检测到的蛋白质点最多，有966个；所有胶中平均检测到有901个点，其中所有图谱共有的点有585个。通过所有蛋白质组图谱中共有的585个蛋白质进行统计学分析，如果正常对照与肾阳虚状态下蛋白质表达的量差异超过1.2倍（增加或者降低），并且4块胶中蛋白质表达量变化的趋势相一致（如图2），则该蛋白质表达差异应该是由实验处理所引起，而不是样品材料和操作过程所带来的误差。根据这个原则，共找到18个差异蛋白，其中有16个蛋白质点在肾阳虚动物中表达量增高，而有2个蛋白质点表达量降低（表1），其在图谱中的分布见图3。
　　
　　
　　3．3质谱分析经蛋白质组图谱分析后差异大于1.2倍以上的蛋白质经胶内酶解后用MALDI-TOF-TOF进行质谱检测，并与蛋白质文库进行比对分析后，其中15个蛋白的分子量与等电点被确定（表1），结果显示：氨甲酰磷酸合成酶、过氧化氢酶、二氢硫辛酸脱氢酶、热休克蛋白60、亚硫酸氧化酶、ATP合成酶、醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、3-巯基丙酮酸转硫酶、腺苷酸激酶同工酶5、谷胱甘肽过氧化物酶表达均增高。16号蛋白质为未命名蛋白质，其生物学功能还需进一步研究。
　　
　　
　　4讨论
　　
　　中医的肾在五脏中居主要地位，被喻为先天之本，生命之源，人体各脏器的调节中心。肾阳虚证是指由于肾阳虚衰，温煦失职，气化失权所表现的一类虚寒证候。常因素体阳虚，或年高命门火衰，或久病伤阳，它脏累及于肾，或因房事太过，日久损及肾阳所致。本证以性与生殖机能减退，并伴见形寒肢冷，腰膝酸冷等虚寒之象为审证要点[7]。临床主要表现为腰膝酸软而痈，畏寒肢冷；头晕目眩，精神萎靡，面色白，舌淡苔白，脉沉细。本研究采用两侧切除肾上腺方法，喂养6天后肾上腺切除大鼠出现少食少饮、体重减轻、反应迟钝、活动减少、拱背耸毛、毛色无光泽、易脱落、大便稀溏等症状，其症状和体征符合肾阳虚症。
　　在本实验中，笔者提取肾阳虚模型及经温补肾阳药治疗后大鼠肝线粒体蛋白质，分别用Cy3 、Cy5荧光染料标记后，与用Cy2标记的内标等量混合，加样于一胶条中进行双向电泳，经扫描后获得内标、模型组大鼠和治疗组大鼠肝线粒体蛋白质组图谱。并对各图谱进行生物学差异分析（BVA）时，图谱中任何蛋白质点先经过内标的校正（即样品中的蛋白质点的值等于该点的测定值与同一块胶的内标中所有蛋白质测定总值的比值），再进行相互比较，消除胶与胶之间的差异和部分实验误差，提高统计的可信度。
　　通过凝胶生物学差异分析共筛选到18个差异蛋白质，经MALDI-TOF-TOF进行检测，并与蛋白质文库进行比对分析后， 15个蛋白质被鉴定，其中14个蛋白的名称、功能、分子量和等电点被确定，其中氨甲酰磷酸合成酶、过氧化氢酶、二氢硫辛酸脱氢酶、热休克蛋白60、亚硫酸氧化酶、ATP合成酶α，β，σ亚基、醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶E1β亚基、3-巯基丙酮酸转硫酶、腺苷酸激酶同工酶5、谷胱甘肽过氧化物酶在温补肾阳药治疗后的肾阳虚动物中表达量均增高，另外3个未被成功鉴定。
　　动物两侧肾上腺切除后，由于肾上腺皮质分泌的糖皮质激素缺陷，影响物质代谢，最终引起机体能量供给的短缺。经温补肾阳药治疗后，肾阳虚动物物质与能量代谢均得到了改善，主要表现在如下几个方面：（1）温补肾阳药治疗后，动物肝线粒体中二氢硫辛酸脱氢酶、醛脱氢酶和丙酮酸脱氢酶表达上升，醛脱氢酶参与了糖和脂类物质氧化脱氢的反应，这些反应是呼吸链上高能电子是最主要来源。丙酮酸脱氢酶E1和二氢硫辛酸脱氢酶是丙酮酸脱氢酶复合体中的二个组分，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶作用下脱羧产生羟乙基-硫氨素焦磷酸，在二氢硫辛酰转乙酰酶作用下与辅酶A作用生成乙酰辅酶A，而还原型的二氢硫辛酰转乙酰酶在二氢硫辛酸脱氢酶的作用下被氧化，使NAD+转变成NADH+H+，乙酰辅酶A进一步进入三羧酸循环，而NADH通过呼吸链氧化产能。因此，以上3个酶表达量增加，有助于代谢物加快分解，有助于糖酵解产物丙酮酸走向柠檬酸循环彻底氧化分解，为机体生命活动提供能量。
　　（2）肾阳虚动物经温补肾阳药治疗后，蛋白质分解代谢速度加快，主要表现为3-巯基丙酮酸转硫酶和氨甲酰磷酸合成酶合成增加，3-巯基丙酮酸转硫酶可反映人体内胱氨酸代谢情况以及缺铁性贫血，它催化3一巯基丙酮酸脱去巯基转变成丙酮酸的反应是半胱氨酸分解代谢的关键步骤。氨甲酰磷酸合成酶是尿素合成的关键酶，主要功能是将氨基酸分解产生的氨合成无毒的尿素，防止出现氨中毒。3-巯基丙酮酸转硫酶和氨甲酰磷酸合成酶合成增加，说明氨基酸分解代谢加速，因此肾阳虚动物经温补肾阳药治疗后，蛋白质分解与氨基酸代谢速度加快，以补充体内能量的不足。
　　（3）肾阳虚动物经温补肾阳药治疗后核酸代谢可能也加快，表现为亚硫酸氧化酶表达增加，质谱鉴定中肽指纹图谱多个片段属于亚硫酸氧化酶中的钼辅助蛋白，而含钼辅助蛋白的酶有黄嘌呤脱氢酶和醛脱氢酶，黄嘌呤脱氢酶使黄嘌呤和次黄嘌呤羟化产生尿酸，醛脱氢酶则可羟化次黄嘌呤转变为黄嘌呤而起到解毒作用。三种酶其钼辅助蛋白具有同源性和共用性，因而肾阳虚动物经温补肾阳药治疗后核酸代谢可能也加快。
　　（4）温补肾阳药治疗后，肾阳虚大鼠ATP合成酶和腺苷酸激酶同工酶5表达量增加，氧化磷酸化速度加快，ATP合成速度加快，以满足机体能量的需求。腺苷酸激酶是一种蛋白激酶，在生物体处于低能量水平时，催化AMP生成ADP，生成的ADP通过氧化磷酸化等被氧化成体内能量的直接供应者ATP，以保证生命活动的正常运转。腺苷酸激酶的提高，可以调节ADP、ATP或dATP的水平，以维持生物体内能荷的稳定。腺苷酸激酶还与核苷酸还原酶相关，进而通过凋亡复合物介导了凋亡过程[8]。
　　此外，经温补肾阳药治疗后肾阳虚动物细胞防御损伤能力加强了，主要表现为热休克蛋白60、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶表达量增加。热休克蛋白是机体在应对不利反应时，细胞产生的一组保护因子，线粒体中热休克蛋白60明显增加，它能调整处于应激状态的细胞存活机能，保护细胞免受损伤，并有利于细胞恢复正常的结构和机能。而肾阳虚动物经治疗后由于三大物质代谢速度加快，可产生大量的自由基和过氧化物，过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶表达增加，可以维持细胞膜的稳定性，避免线粒体因脂质过氧化作用而受到损伤[9]。
　　综上所述，经温补肾阳药治疗后肾阳虚动物糖代谢糖、脂类、蛋白质和核酸分解代谢加强，ATP生成速度加快，以弥补机体能量不足；另外，温补肾阳药还可能通过保护细胞免受损伤，清除自由基和过氧化物，避免指质过氧化而受到损伤，维持线粒体膜的稳定定性，从而起到治疗肾阳虚的作用。
　　
　　参考文献
　　［1］董兴刚, 张庆怡, 陈以平.肾阳虚证的研究进展[J].中国中西医结合肾病杂志,2003，4（5）：299-230.
　　[2]陈英华,孙琪,欧阳轶强,等,肾阳虚动物模型造模方法综述.中国医药学报,2003,18(6):370-372.
　　[3]卢德赵, 沃兴德, 施孟如, 等.激素型肾阳虚动物肝线粒体蛋白质组与能量代谢相关性研究[J]. 中国生物化学与分子生物学报,2005,21（6）：807-814.
　　[4]Dlugosz A,Piotrowska D.Lipid peroxidation stimulated by Solvesso,Bawanol and methanol,and its counteraction by antioxidants in human placental mitochondria1[J].Toxicol In Vitro,2002,6(1):649-6561.
　　[5]Karp N A,Kreil D P,Lilley K S.Determining a significant change in protein expressinon with DeCyderTM during a pair-wise comparison using two-dimensional difference gel electrophoresis[J].Proteomics,2004,4(5):1421-1432.
　　[6]Friedman D B,Hill S,Keller J W,et al.Proteome analysis of human colon cancer by two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry [J].Proteomics,2004,4(2):793.
　　[7]张伟荣. 肾阳虚证动物实验研究简述及展望[J]. 中医药学刊,2006,24(10):1809-1811.
　　[8]Schulze DU, Düfer M, Wieringa B,et al.An adenylate kinase is involved in K(ATP) channel regulation of mouse pancreatic beta cells[J].Diabetologia, 2007, 50(10):2126-2134.
　　[9]罗东林,周继红,刘宝华,等. 糖皮质激素、糖皮质激素受体和热休克蛋白对大鼠严重创伤后早期肝损伤的作用机制［J］.中华急诊医学杂志,2003,12(10)：664-666.