【结核杆菌对利福平药物的敏感性试验】 结核杆菌及利福平耐药
时间：2019-01-17 04:28:50 来源：达达文档网 本文已影响 人 
【摘要】目的 分析结核分枝杆菌对利福平的耐药现况，为结核病的防治提供依据。方法采用直接涂片检查法和培养法，对肺结核病人的痰液进行检查，阳性标本经抗酸染色镜检确认后，采用绝对浓度法的间接法进行耐药性确定，结果 131例疑似肺结核病人痰标本中，直接涂片法检出阳性标本21例，阳性检出率为16.0%（21/131）；培养法共检出阳性标本56例，阳性检出率为42.7%（56/131）；比较两种检测方法的阳性检出率，差异有显著性（P＜0.05）。培养法高于直接涂片法，将培养阳性标本进行利福平药物敏感性试验，其中有17株发生耐药，耐药率为30.4%（17/56），结论 结核杆菌对利福平的初始耐药率仍处在较高水平，必须进一步加强对耐药结核杆菌的监控。
【关键词】结核分枝杆菌 利福平 药敏试验
中图分类号：R378 文献标识码：B 文章编号：1005-0515（2011）5-260-02
结核病是我国重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题，世界卫生组织已将结核病作为重点控制的传染病之一。全球80%的结核患者分布在22个结核病高负担国家，中国是其中之一，结核患者人数仅次于印度居世界第二位[1]。但是，近10年来，临床上发现抗结核药的耐药性对结核病化疗效果的影响日益严重，尤其是利福平耐药的发生率不断上升给抗结核治疗带来较大的困难。为了解结核杆菌对利福平耐药的状况，为临床合理、联合用药提供依据，特作本研究。结果报告如下：
1.1病例来源
2007年11月～2008年9月，在青海省海西州人民医院、海西州疾控中心检查首次确认为肺结核的病人，共131例。病例发病前均未服用过抗结核药物。结核分枝杆菌参考菌株为H37Rv敏感株，由中国结核病防治临床中心国家参比实验室提供。
1.2痰液直接涂片检查
用接种环取脓性痰液1～2环，均匀涂于载玻片上，待自然干燥，微火焰固定，经抗酸染色后镜检。
1.3分枝杆菌培养
1.3.1培养基
为酸性罗氏培养基。成分：谷氨酸钠（纯度95%以上）7.2g,KH2PO414g,MgSO4・7H2O0.24g,枸橼酸镁0.6g，甘油12mL，蒸镏水600mL，马铃薯淀粉30g，新鲜鸡卵液1000mL，2%孔雀绿水溶液20mL。
制备方法
各盐类成分溶解后，加马铃薯淀粉，混匀，沸水浴煮沸1h呈湖状（不时摇动，防凝块），待冷后，加经消毒纱布过滤的新鲜鸡卵液，混匀，再加入2%孔雀绿水溶液，混匀，分装于经121℃高压灭菌的中型度管，每管加培养基约4mL,斜置血清凝固器内1～2层，斜面高度占试管2/3.90℃1.5h或85℃1h间歇2次。冷却后，37℃无菌试验24h。培养基斜面颜色鲜艳，表面光滑无泡，有一定韧性和酸碱缓冲能力，4℃保存，1个月内使用。
1.3.3接种方法
取痰标本1～2mL，加入1倍量4%NaOH，于室温下放置30min（期间振荡2～3次）后，取处理消化后痰液0.1mL，无菌操作接种于培养基斜面上，每份标本同时接种2坛酸性改良罗氏培养基，放置37℃恒温箱培养。每周观察1次，记录细菌生长情况，至8周为止。
1.4过敏试验
具体操作参照结核病诊断细菌学检验规程[2]。
1.4.1药物
利福美国Sigma公司生产，北京索莱宝科技有限公司提供。为纯品，粉剂。
1.4.2培养基
改良罗氏培养基。成分：谷氨酸钠（纯度95%以上）7.2g,KH2PO4・2.4g,MgSO4・7H2O2.4g,枸橼酸镁0.6g，甘油12mL，蒸镏水600mL，马铃薯淀粉30g，新鲜鸡卵液1000mL,2%孔雀绿水溶液20mL。
1.4.3制备方法
制备方法同酸性罗氏培养基，只是在培养基制成后分装于中型试管前，按每100mL培养基加入1mL利福平稀释药液，混匀，再行分装中型试管，加温凝固成斜面。
1.4.4利福平药液配制及稀释
利福平药物为纯品，生物效价为1000μg/mg，配制2个浓度的含药培养基，药物浓度为：50μg/mL、250μg/mL。根据痰培养阳性标本例数，每支试管含培养基4mL，计算所需培养基体积。每100mL培养基加入1mL利福平稀释药液。
1.4.5菌悬液的制备及接种方法
参照《全国临床检验操作规程（第3版）》进行。
1.4.6质控
每批药敏试验应以结核分枝杆菌参考菌株（H37Rv）检测含药培养基质量。
1.4.7结果判定
对照培养基菌落数必须在200以上且无融合。若菌浇数低于50时，重新做药物敏感性测定。
（-）：培养基斜面上无分枝杆菌菌落生长。
（1+）：菌落数约占斜面面积的1/4。
（2+）：菌落数约占斜面面积的1/2。
（3+）：菌落数约占斜面面积的3/4。
（4+）：菌落呈菌苔样生长。
菌落数少于20个时，报告菌落数。含药培养基菌落数少于20个时，当作不生长。低浓度含药培养基上生长的菌落数多于20个时，即可判定为耐药。低浓度生长、高浓度不生长为中度耐药；高、低浓度均生长为高度耐药。
2结果
2.1痰涂片情况131例肺结核病人标本中，共有21例痰涂片为阳性，阳性率为16.0%。
2.2痰培养情况131例标本中，经培养有菌生长且经抗酸染色镜后，共有56例确定为结核分枝杆菌，阳性检出率为42.7%。两种检测方法其阳性检出率比较，差异有显著性（P＜0.05）。培养法高于直接涂片法。与直接涂片法比较：*P＜0.05（x2检验）
2.4药敏试验结果
质控H37Rv生长情况：对照培养基为4+，高、低浓度含药培养基均不生长，为敏感。故所配制的培养基质量合格，能用于药物敏感性测试。
56株痰培养阳性标本中，共有17株出现耐药，总耐药率为30.3%，其中，属中度耐药有10株，耐药率为17.8%，属高度耐药有7株，耐药率为12.5%。
3讨论
直接涂片检查法和分枝杆菌培养法是结核实验室诊断中常用的2种方法，2种方法的阳性检出率对结核病实验室诊断有重要影响。本研究中培养法阳性检出率高于直接涂片检查法。因此，临床上可将2种方法结合使用，以提高结核菌的阳性检出率。
耐药性试验不仅是临床选择和评价化疗方案的依据，更是流行病学的重要指标。利福平自1971年发明以来，一直是结核化疗方案中的一个关键药物，特别在短程化疗中起着重要作用。而对利福平的耐药意味着一方面由于患者对利福平耐药，临床上须加大用药剂量或改用其他抗结核药物，使患者的疗程延长，增加患者的危险和经济负担；另一方面扩大耐药性传播的机会，使得总体人群暴露于耐药结核杆菌的危险性增加。
研究表明，利福平产生耐药是由于其作用靶分子RAN多聚酶亚单位的编码基因（rpoB）突变所致。由于结核分枝杆菌产生自然耐药变异的频度很低，造成耐药的主要原因是治疗过程不合理的联合用芭、间断用药、不执行归口管理与治疗等。因此，在今后的结核病防治工作中，重点为社会性综合防治措施，抓好结核病人的发现、登记、管理和合理治疗。坚持在直接面视短程化疗（DOTS）下，早期、适量、规律、全程、联合应用敏感药物或抗结核药物复合剂辅以免疫治疗地，使得在强化期内迅速、大量杀灭结核菌，使痰菌转阴。对于耐药病例防治，须坚持联合用药的原则，根据既往用药史和药物敏感性试验制定个体化治疗方案。结核病防治有关部门也应加强对耐药菌株的检测，掌握结核病耐药趋势，以指导临床合理、有效用药。
参考文献
[1]中国防痨协会，结核病诊断细菌学检验规程[J].中国防痨杂志.
[2]刘宇红、姜广路、赵立平等.第四次全国结核病流行病学抽样调查－结核分枝杆菌耐药性分析与评价[J].中华结核和呼吸杂志.
[3]李国明、吴兴荣、张缇等.湖北省结核分枝杆菌耐药性监测研究.
