天麻蜜环菌选择性共生机理研究进展

杨林 王传华 刘盼盼 周斌

摘要：天麻（Gastrodia elata Bl）具有较高的营养价值和药用价值，已被医学和药学界广泛关注，其食药用价值正不断地被研究认识和开发利用。通过对天麻与蜜环菌生物种的共生关系进行综述，以期为天麻栽培育种提供参考。

关键词：天麻;蜜环菌;共生机制

中图分类号：S-3文献标识码：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20200815005

收稿日期：2020-06-30

基金项目：铜仁市科技局项目（项目编号：2017TRS60223）;国家自然科学基金项目（项目编号：31570543）

作者简介：杨林（1986-），男，硕士。研究方向：食用药用真菌;通讯作者王传华。

天麻（Gastrodia elata Bl.）为兰科（Orchidaceae）多年生共生（Symbiosis）草本植物，是传统名贵中药，含丰富的多糖、天麻素、苷类、甾醇等活性物质，具有防癌、抗肿瘤、抗炎、镇痛、抗衰老、降低血糖等效果。天麻自身无光合作用，需从入侵的蜜环菌中获取营养物质而生长发育[1]。其种子的萌发，需从紫箕小菇（Mycena osmuudicola Lange）、兰小菇（Mycena orchidicola）等共生萌发菌中吸收营养。而天麻种存在 6个遗传性状不稳定的变型，包括毛天麻（G.elata BL.f. pilifera）、绿天麻（G.elata BL. f. viridis）、乌天麻（G.elata BL. f. glauca）、松天麻（G.elata BL. f.alba）、红天麻（G.elata B1.f.elata）和黄天麻（G.elata BL. f.falvida）[2，3]，其中乌天麻和红天麻的利用价值最高[3]。

蜜环菌属真菌（Armillaria（Fr.：Fr.）Staude）真菌隶属担子菌亚门（Basidomycotina）层菌纲（Hymenomycetes）伞菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae），其中部分种具有很高的食药用价值。目前全球已鉴定出40多个生物种[4];我国已鉴定出14个有环的蜜环菌生物种和1个无环的蜜环菌（假蜜环菌），但仅有5个生物种A. gallica（高卢蜜环菌）、A. jezoensis（北海道蜜环菌）、A. sinapina（芥黄蜜环菌）和A. singula（单生蜜环菌）、A. solidipes（奥氏蜜环菌）能与天麻实现有效共生[5]，而有效共生的蜜环菌生物种对同种天麻具有不同侵染性，使得蜜环菌生物种与天麻间的共生关系存在选择性。加之各蜜环菌生物种子实体和蜜环菌索的形态特征非常相似，而成为天麻栽培和产量中遇到的实际困难。

20世纪60年代以来，我国学者在天麻有性繁殖[6，7]、天麻生物学特性[8]、繁殖[6]、分类[2]、杂交育种[9]等方面研究取得了一定进展。出版了《天麻栽培学》专著[3]，实现了天麻的人工栽培。建立了部分天麻变型的高效液相指纹图谱[10]。在蜜环菌入侵机制与天麻防御、消化、吸收过程等方面也进行一定研究[11-14]，确认了蜜环菌是天麻的主要营养来源;发现了天麻与蜜环菌之间包含着寄生、共生和反寄生3种关系[14]及正常生理侵染和病理侵染2种状况[11];初步说明了密环菌种与天麻种之间存在选择性[5，15，16]。综合各方面的研究，蜜环菌生物种对天麻种的毒性、致病性等方面确实存在显著差异。但其共生选择性机制目前已取得相应进展，从而有望将成为我国天麻与其共生蜜环菌种的科学合理组合配种有效依据，也将突破我国菌农获得优质、高产天麻的一道技术屏障。现就目前天麻与蜜环菌的共生基础特性做如下综述。

1蜜环菌生物种菌索发育的研究

通过多年的研究，明确了蜜环菌以菌索形态侵染天麻，而天麻则同化蜜环菌而获得营养[17]，蜜环菌菌株的生长速度与天麻产量呈正相关，蜜环菌的生长速度与菌材种类有密切关系[18]。菌索的生长和发育受碳源、氮源、无机营养[19]、维生素[20]、有机生长因子[21]、酚类物质[22]、植物提取液、某些氨基酸[23]、矿质营养状态等因素的影响，钾离子、有机物质[24]、松树皮混合肥[25]能够刺激其生长，高氮和磷则抑制其生长[24]。Garraway等[26]的研究也认为蜜环菌的生长发育受其生理和生物化因素影响。而Garrett[27]首次通过纯培养研究了蜜环菌菌索的诱导，证实了实验诱导蜜环菌产生菌索与营养因素有关。在菌种间的关系方面，曾春函等[28]采用8种密环菌两两组合培养研究蜜环菌菌索的相互作用，发现部分菌种存在相互拮抗作用，部分组合菌种菌索彼此出现“远离”或“靠近”现象，同时两两组合在促进菌索发育速度存在明显差异。因此可以推论营养、环境、遗传是影响蜜环菌生长发育的关键因素。蜜环菌生物种对不同的天麻种具有不同的侵染性，是使蜜环菌生物种与天麻种之间存在选择共生性的基础;蜜环菌生物种之间具有拮抗效应和互交不育性，也是影响天麻产量的重要因素。同时许多研究[29-31]也支持不同蜜環菌菌种是影响天麻品质的重要因素。

2蜜环菌生物种侵染天麻的组织学过程研究

蜜环菌侵入天麻首先需要形成菌索，菌索附着在天麻表皮，由菌索长出菌丝，然后菌丝以机械力量和分泌化学物质[32，33]穿透到天麻皮层，菌丝侵入皮层最内层细胞后，以菌丝的形式沿着皮层细胞成束地向四周扩散[34，35]，同时菌丝释放漆酶等化学物质，而漆酶的产生伴随菌索的出现而出现[32];在此过程中应该是，蜜环菌产生的相应酶类首先消化天麻皮层细胞，被消化了的皮层细胞逐渐形成内吞管状结构，在此过程中天麻收到皮层细胞被侵害信号后，诱导天麻内皮层细胞产生保护性措施，使之产生许多水解酶类，产生的酶被内质网或高尔基体包裹成小泡向细胞外运输和释放，被释放的水解酶将入侵的菌丝降解为小分子物质被天麻吸收[14]，从而为天麻提供源源不断营养助其生长。菌索入侵天麻的方式可能与Morrison等[36]研究蜜环菌侵染木材的形式相似，其侵染过程为蜜环菌首先在木材皮层外形成菌索，菌索分泌一些粘液基质覆盖在菌索的生长点，菌索顶端变硬而附着，附着点的菌索长出菌丝，然后菌丝以机械力量和分泌化学物质穿透到寄主皮下。在蜜环菌侵入天麻的细胞结构研究中，徐锦堂等[37]研究表明蜜环菌菌丝由天麻皮层的菌丝流细胞经纹孔侵人大型细胞，其通道细胞被真菌所破坏而形成共生关系，但消化细胞通过反寄生而获取密环菌的营养[14]。而董兆彬等[38]分别运用电子显微镜和光学显微镜研究了蜜环菌侵染天麻后皮层的3种细胞结构变化，得出天麻同化蜜环菌的过程需要经过若干皮层细胞和大型细胞共同完成。天麻细胞溶酶体是菌丝消化和自溶的重要细胞器，其中含有大量的酸性磷酸酶[39，40]。为了确定不同染菌细胞在消化蜜环菌过程中的作用，王货等[13]采用酸性磷酸酶的细胞化学定位方法进行了研究，说明了天麻皮层细胞不能释放水解酶消化菌丝，只有消化层细胞能释放磷酸酶消化菌丝;因而说明天麻的皮层细胞中消化细胞层是天麻消化和吸收蜜环菌营养的主要场所，与Kusano[41]研究结果相同;但并没有证明蜜环菌侵入天麻表皮层时天麻是通过何种诱导机制克服了蜜环菌的病理性入侵及其生理性变化。

在生理方面，胡忠[42]从天麻顶生球茎中分离出一种抗真菌蛋白（Gastsodia Antifungal Protein.GAFP），在天麻球茎外层组织中含量较多，内层薄壁组织没有，认为该蛋白（GAFP）在天麻当年顶生和侧生球茎中对阻止真菌的侵染和防卫中起重要作用。杨增明等[43]从天麻的初生球莖分离出几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶，显示出其对蜜环菌的侵染防御性不高。Morrison[36]研究了全球不同地区23个蜜环菌生物种的毒性与菌索形态的关系，认为其侵染性与蜜环菌索的生长特性密切相关，进一步说明不同蜜环菌对天麻表皮层细胞侵染性不同。

3蜜环菌胞外酶对天麻的影响

近年来，许多研究者也注意到蜜环菌和天麻的胞外酶对两者的生长发育起着关键作用，王贺[13]用溶酶体酸性磷酸酶的细胞化学方法详细研究了两者之间的关系，发现天麻皮层消化细胞是释放水解酶消化真菌的主要场所。邹宁等[44]采用蜜环菌（A.mellea）的胞内胞外提取物对天麻进行组织培养，得出胞内提取液有相应的抑制效果，胞外提取液有促进效果。曾春函等[45]研究了8种蜜环菌的胞外漆酶、果胶酶和纤维素酶的生物活性，得出各蜜环菌首先分泌果胶酶和纤维素酶，然后才是漆酶。刘晓杰等[46]研究了黄绿蜜环菌的葡萄糖基转移酶酶活性，结果表明30℃下酶活稳定性最高，pH值在6～7范围内酶活稳定最好。而谭彧文等[47]采用蜜环菌与天麻实现共生的区域，获取其RNA进行转录组分析，得出蜜环菌侵入到天麻内皮层后，胞外酶纤维素酶、木聚糖酶、漆酶以及多聚半乳糖醛酸酶基因大部分处于下调状态，与曾春函等[45]的研究结果相吻合。说明蜜环菌侵入天麻内皮层后其侵染性基因受到相应地抑制。

4天麻营养的供给

兰进等[48]运用显微放射自显影的方法研究了蜜环菌吸收消化3H-葡萄糖后再侵染天麻的过程，得出蜜环菌能吸收消化周围环境中的3H-葡萄糖，吸收3H-葡萄糖的蜜环菌再侵染天麻皮层细胞时，菌丝被溶解、消化，然后经天麻维管运输使3H分布于天麻细胞的各个细胞器中。王货等[14]认为天麻摄取真菌营养的过程是一个复杂的消化吸收过程，其为先消化后吸收，且是天麻营养的主要来源。徐锦堂等[1]的研究表明，蜜环菌索侵入天麻营养茎、繁殖茎后，形成菌丝流，其向内直接侵入大型细胞被天麻消化作为营养;而切断天麻与菌材连接的蜜环菌索，新生麻就停止生长。说明菌丝通道是天麻整个生长期营养的补给线。庄毅[49]通过同位素标记方法，得出天麻除从蜜环菌获得营养外，还可以从土壤中得到补充。吴沿友等[50]研究认为天麻矿物质吸收途径：通过蜜环菌的“泵”作用获得;天麻自身也可直接从外界环境获得部分养分。

5天麻防卫系统和“食菌”系统

胡忠[42]从天麻顶生球茎中分离抗真菌蛋白（Gastsodia Antifungal Protein.GAFP），球茎外层组织富含，内层薄壁组织没有。认为该蛋白（GAFP）在阻止真菌对当年生顶生和侧生球茎的侵染和防卫机制中起重要作用。之后江流等[51]采用免疫荧光定位法，证实了GAFP在天麻次生块茎表皮含量较高，皮层相对较低。同时胡忠等[52]也采用免疫荧光法说明了GAFP是密环菌侵染天麻营养茎后被大量合成，之后输送至顶生球茎，积累于皮层细胞，是使顶生球茎处于拒菌状态的一种重要蛋白。胡忠等[53]又深入地研究了GAFP-Ⅰ的氨基酸序列和cDNA核苷酸序列，得出GAFP抗菌活性可能与蜜环菌表面某种糖配基专一结合而发挥作用。而徐荣华等[54]运用荧光试剂异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate， FITC）标记法，证明了GAFP对木霉菌丝作用位点在细胞壁上。刘成运[55]借助于荧光显微镜研究了蜜环菌侵染天麻过程中的一系列变化，发现酸性磷酸酶、脂酶主要分布在含蜜环菌菌丝的天麻皮层细胞，而脂酶在大型细胞的丛状体、崩解核及含菌丝的天麻皮层细胞活性强烈。ATP酶、多酚氧化酶、过氧化物酶在天麻菌丝皮层细胞和大型细胞内活性明显。通过对天麻营养来源的进一步研究，许多研究认为皮层细胞和大型细胞参与了消化，而天麻皮层的抗真菌蛋白是抵御蜜环菌入侵的主要物质[3，42，56，57]，皮层细胞、消化细胞释放溶菌酶、消化酶、几丁质酶等对入侵菌丝流发挥消化起关键作用[3，55]。而实践也证明只有健康的菌索能与休眠期和萌发期的原生球茎实现共生生长，不能与新生和旺盛期天麻实现共生。

6问题与展望

综合以上各方面的研究，天麻与蜜环菌的选择机制还需进一步研究，相比其它真菌的侵染植物体系均存在相应的诱导机制、向触性，当蜜环菌侵入植物体后是如何实现共生关系的，实现共生关系的机制如何，目前知之甚少。而在蜜环菌侵入天麻皮层后，天麻植物体内多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL又是怎样表达与调控的，在这过程中又发挥着何种作用，都还不甚了解。虽然在蜜环菌基因研究方面有了一些研究，但是均为菌种的鉴定方面，如Tsykun等[58]研究了欧洲6个蜜环菌种的3个DNA核糖体区域基因（IGS-1，ITS，EF-1a）的表达性;但是在天麻相应基因是如何诱导相应的蜜环菌为其提供营养及其如何防御蜜环菌进一步侵入使其不发生病理性侵害这方面研究得很少。然而天麻生物种基因的差异性表现出的调控能力和蜜环菌生物种基因表现出的侵染强弱应该是天麻生物种与蜜环菌生物种选择共生性的基础。同时，从天麻生长繁衍的角度看，天麻生物种对相应蜜环菌的诱导性强大，蜜环菌的入侵性较弱，则天麻生长;相反，如果诱导性较弱，入侵性较强，则天麻被吞噬，因此只有具备强大的诱导系统的天麻种与入侵较弱的蜜环菌种结合，才能使天麻通过相应的策略获得营养以维持自身的生长繁衍。为此天麻对蜜环菌的选择共生机制还需进一步研究明确。

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（责任编辑李媛媛）