分子标记辅助选育甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂恢复系

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摘 要：

选育抗磺酰脲类除草剂的甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育（polima cytoplasmic male sterility，pol CMS）恢复系，为培育抗除草剂pol CMS“三系”杂交种打下基础。以甘蓝型油菜pol CMS恢复系2350C为母本与抗磺酰脲类除草剂油菜M342杂交，利用苯磺隆除草剂在F2分离群体中筛选抗性单株，采用分子标记辅助选择纯合抗性植株并与pol CMS不育系测交，鉴定携带纯合pol CMS恢复基因的单株，经过多代自交成功选育了抗除草剂的pol CMS恢复系18Z363，利用18Z363配制的抗除草剂pol CMS“三系”组合中有1个比对照品种油研50增产3.85%、2个组合与对照产量持平，表明该恢复系具有一定的配制高产组合的潜力。

关键词：

甘蓝型油菜;磺酰脲类除草剂;波里马细胞质雄性不育;分子标记辅助选择;苯磺隆

中图分类号：S565.4

文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191230014

油菜是重要的油料作物和经济作物之一，在我国广泛种植[1];油菜生产易受双子叶阔叶类杂草侵害[2]，防治难度较大，油菜生产因草害造成的减产严重[3];此外，受我国经济发展的影响，农村劳动力缺乏，人工除草增加了劳动力的投入，降低了油菜生产的效益，因此使用除草剂控制油菜田杂草优势明显。磺酰脲类除草劑具有毒性低、半衰期短、残留少等优点，在防治阔叶类杂草中应用广泛[4]，筛选、培育抗磺酰脲类除草剂的油菜品系已是当前油菜育种的重要目标之一[5]。波里马细胞质雄性不育（polima cytoplasmic male sterility，pol CMS）是第1个有实用价值的油菜细胞质雄性不育类型，已被广泛应用于油菜杂交种的配制[6]，而选育pol CMS恢复系是配制油菜“三系”品种的重要环节。因此，抗磺酰脲类除草剂的pol CMS恢复系的选育对培育抗除草剂油菜品种以解决我国油菜生产田间化学除草难题具有重要意义。磺酰脲类除草剂主要通过抑制植物乙酰乳酸合酶（Acetolactate synthase，ALS），使亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等 3种支链氨基酸生物合成受阻，蛋白质合成停止，最终导致植株死亡[7]，利用ALS基因突变可以创制抗磺酰脲类除草剂的种质资源。在油菜中，加拿大学者率先报道了突变ALS基因获得除草剂抗性材料[8];近年来，国内对ALS为靶向的抗除草剂油菜也开展了大量研究，高建芹等[9]在喷施除草剂的油菜-大豆轮作田里也发现了抗ALS抑制剂类除草剂的油菜自然突变资源M9，具有一定的实用价值;随后江苏省农科院经济作物研究所采用EMS诱变油菜品系N131创制了多个抗除草剂的油菜资源[10， 11]。孙妍妍等[12]在筛选甘蓝型油菜中双9号EMS诱变库时发现了抗苯磺隆的突变株，研究发现抗性植株ALS基因发生了突变，随后研究者根据ALS基因突变位点成功设计了等位基因特异的引物，可以用来进行分子标记辅助选择抗除草剂的转育后代;Li等[13]在用苯磺隆进行油菜化学杀雄配制杂交种过程发现了1个ALS基因突变的抗苯磺隆材料，根据ALS突变位点开发的dCAPS标记与苯磺隆抗性共分离;Hu等[14]采用EMS诱变获得了具有实用价值的抗磺酰脲类除草剂油菜资源M342，随后程丽等[15]等根据M342的ALS突变基因设计了CAPS标记，在M342与不抗材料杂交后代分离群体中验证发现该标记可以有效区分纯合抗性、杂合抗性和纯合不抗除草剂的单株;这些研究为采用分子标记辅助转育抗磺酰脲类除草剂材料提供了重要参考。Pol CMS恢复系是配制pol CMS“三系”品种的关键，研究认为油菜的pol CMS恢复基因是1对显性主效基因[16]，可通过杂交来进行恢复基因的转移，通过与pol CMS不育系的测恢来筛选携带纯合恢复基因转育单株[17]，以创制不同遗传背景的恢复系。

本研究利用M342为抗磺酰脲类除草剂基因来源，采用分子标记辅助选择，结合苯磺隆抗性鉴定、pol CMS测恢鉴定，快速获得抗磺酰脲类除草剂的pol CMS恢复系，减少了工作量，加速了转育进程。

1 材料与方法

1.1 供试材料和试剂

1.1.1 实验材料

甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂种质M342[14]由江苏省农业科学院经济作物研究所提供;pol CMS恢复系2350C[17]及pol CMS不育系J068A 、LDX370A、LDX374A、LDX380A、LDX414A、LDX422A、LDX6-18A、LDX82-11A、LDX92-11A、LDX95-58A、常规03A由贵州省农业科学院贵州省油料研究所提供;组合比较对照品种油研50（CK）由贵州省油菜研究所提供。

1.1.2 实验试剂

Ex Taq、dNTP、DNA Marker等购自宝生物工程（大连）有限公司;Gold View核酸染料、琼脂糖购自北京索莱宝科技有限公司;BsrD I（New England Biolabs）购自NEB（北京）;苯磺隆（有效成分10%，可湿性粉剂）购自安徽省圣丹生物化工有限公司;引物合成委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 DNA提取及除草剂抗性基因的分子标记检测

采用CTAB法提取甘蓝型油菜转育后代单株的叶片基因组DNA[18]，用于分子标记辅助选择;DNA提取后采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，用Nanodrop2000测定浓度;利用程丽等[15]公布的引物（M342 F：5’-GTTTGCGAGCAGGGCTAAGA-3’，M342 R：5’-GACATCCAACAGGTACGGTCCA-3’）和方法进行抗磺酰脲类除草剂基因的转育跟踪：采用M342F+M342R引物用Ex Taq 进行PCR扩增，PCR产物用BsrD I限制性内切酶酶切，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，携带纯合除草剂抗性基因的单株电泳产物为766bp单一条带，携带杂合除草剂抗性基因的单株电泳产物为766bp、570bp、196bp 3条条带，而不抗除草剂单株为570bp、196bp 2条条带。

1.3 实验材料田间种植

F2分离群体种植：按2m宽、10m长厢面均匀撒播，3～6叶期喷施苯磺隆，喷施14d后选抗性单株按行长2m、行距40cm、株距25cm移栽。转育后代自交材料田间种植：行长2m、行距40cm、每行按穴距25cm小穴点播3～5粒油菜种子，3～6叶期定苗，每穴留苗1株。测恢组合种植：行长2m、行距40cm、每行按穴距25cm小穴点播3～5粒油菜种子，不匀苗，花期调查育性。pol CMS“三系”组合鉴定试验：设置5行1小区，随机区组排列，3次重复，对照品种为油研50;行长2m、行距40cm、每行按穴距25cm小穴点播3～5粒油菜种子，3～6叶期定苗，每穴留苗1株。

1.4 苯磺隆田间鉴定油菜除草剂抗性

幼苗3～6叶期，用苯磺隆（有效成分10%，可湿性粉剂）稀释成400mg/L工作药液，按18 g.a.i/hm2的用量喷施，14d后调查死亡情况和受抑制情况。

1.5 抗除草剂pol CMS恢复系选育过程

2015年春选健壮的pol CMS恢复系2350C单株做母本，以M342为父本，人工去雄配制杂交组合，成熟后收获F1杂交种，并于2015年5月种植于贵州省威宁县麻乍镇（纬度：N 26°64′，经度：E 104°09′，海拔：2223.50m），套袋自交并于2015年9月底收获自交种。2015年9月底在贵州省油料研究所贵阳试验地种植F2分离群体，于2015年11月中旬幼苗3～6叶期喷施苯磺隆除草剂，不携带抗性基因的单株死亡淘汰;选择健壮的存活单株用M342F+M342R引物进行分子标记辅助选择，保留携带纯合除草剂抗性基因的单株，在2016年春季花期套袋自交，并按单株取花粉与pol CMS不育系LDX95-58A进行测交。2016年5月收获单株自交种及测交组合到威宁进行夏繁，开花期调查测交组合的育性，淘汰部分植株不育、全不育及恢复度差的测交组合所对应的F2单株，选全可育组合对应的F2单株后代套袋自交。2016年9月收获自交种后进行品质分析，筛选“双低”单株继续种植并套袋自交、夏繁、品质分析，至F7代选整齐稳定株系18Z363与pol CMS不育系测交及组合配制，2018年9月种植18Z363的F8株系及配制组合，进行苯磺隆除草剂抗性鉴定及花期恢复性调查，确定18Z363为新选育的抗磺酰脲类除草剂pol CMS恢复系。

1.6 农艺性状调查

成熟期，自交系、组合比较试验各小区随机取10株，采用常规方法考察株高、一次有效分枝高度、一次有效分枝数、主花序长、主花序角果数、单株有效角果数，每株取1次分枝中部30个角果计算每角果粒数，单株脱粒测量单株籽粒产量并测量千粒重;采用FOSS NIR System近红外分析仪（美国）进行品质分析;考种取样后按小区收获并测量小区产量。

1.7 数据处理

用Excel2013汇总整理数据，采用SPSS22.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 分子标记辅助选择选育抗除草剂pol CMS恢复系18Z363

用2350C与M342配制杂交组合，经夏繁加代获得F2分离群体，喷施苯磺隆后从F2分离群体中鉴定出抗除草剂单株213株，按单株提取叶片DNA，采用M342F+M342R引物进行PCR扩增，扩增产物用BsrD I酶酶切后经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测可见（图1）：抗苯磺隆除草劑材料M342仅在766bp处有特征条带，pol CMS恢复系2350C和不育系LDX95-58A为不抗除草剂材料，电泳显示有570bp、196bp 2条条带（图1B），而2350C与M342配制的F1带型为766bp、570bp、196bp 3条条带（图1A），表明携带纯合除草剂抗性基因的植株表现为仅在766bp处有1条特征条带，携带杂合除草剂抗性基因带型为766bp、570bp、196bp 3条条带。根据分子标记的带型从F2抗除草剂单株中挑选出携带纯合除草剂抗性基因单株67株，于2016年春套袋自交并按单株与pol CMS不育系LDX95-58A测交。

2016年5月收获67份单株自交种和测交组合进行夏繁，于盛花期鉴定测交组合的育性恢复情况发现，67份测交组合中有27个全不育、18个有不育/可育株分离、22个全可育，选择22个全可育组合所对应的F2单株后代套袋自交，收获自交种113份，品质分析筛选获得芥酸<1%、硫甙<40μmoL/g、含油量>40%的单株17份，2016年10月种植筛选的17个单株自交种，衍生成17个株系并按生育期稍早、一次分枝多、株型紧凑、株高适中、芥酸<1%、硫甙<40μmoL/g、含油量>40%等标准定向选育到F7代，选择综合性状优良的株系18Z363与pol CMS不育系配制组合，发现该株系对pol CMS为全恢;喷施苯磺隆除草剂鉴定发现18Z363和抗磺酰脲类除草剂材料M342能够正常生长，而不抗除草剂材料2350C叶片发红、发黄，逐渐死亡，表明抗磺酰脲类除草剂pol CMS恢复系18Z363选育成功。

2.2 18Z363的主要农艺性状

2019年5月初油菜成熟期，考察18Z363及亲本2350C、M342的农艺性状可见（表1），选育的18Z363株高、主花序长度、含油量及芥酸含量等性状与亲本2350C、M342差异不显著;18Z363的分枝高度、一次有效分枝数及单株角果数介于两亲本之间;18Z363的主序角果数、主序结角密度、每角粒数及千粒重接近亲本2350C，而硫代含量及单株产量接近亲本M342;此外，经过生育期的多代定向选择，18Z363的生育期为220d，长于2350C的213 d，短于M342的335 d。这些结果表明18Z363综合了亲本2350C、M342的部分优良农艺性状。

2.3 抗除草剂pol CMS恢复系18Z363的组合配制

用18Z363与贵州省农业科学院贵州省油料研究所选育的11个优良pol CMS不育系配制组合，苗期除草剂鉴定发现所有组合喷施苯磺隆除草剂后能够存活，而对照品种油研50喷药后14 d叶片发黄，逐渐死亡。采用分子标记鉴定可见18Z363在766bp处有特征条带，说明18Z363携带纯合的除草剂抗性基因（图2A），而油研50及不育系显示为570bp、196bp 2条带，表明其不携带除草剂抗性基因;采用18Z363与11个优良pol CMS不育系配制的组合有766bp、570bp及196bp 3条带，说明这些组合携带杂合的除草剂抗性基因（图2B）。

成熟期考种发现（表2）：18Z363与J068A配制的组合小区产量最高，达到1.08±0.01kg/小区，比对照品种油研50增产3.85%，18Z363与LDX380A、LDX6-18A配制的组合产量与油研50基本持平，而18Z363与其他不育系配制的组合产量都显著低于对照油研50，可见恢复系18Z363在配制优势杂交组合上具有一定的潜力;18Z363配制的11个组合与对照品种油研50的农艺性状考察发现，高产组合J068A×18Z363、LDX380A×18Z363、LDX6-18A×18Z363及对照油研50的一次分枝数、主花序较长、主花序角果数、单株角果数、每角粒数及单株籽粒产量等性状不同程度地高于低产组合LDX92-11A×18Z363、LDX374A×18Z363、LDX82-11A×18Z363。

3 讨论

利用除草剂进行油菜田的杂草防治，可以减少人工除草的劳动力投入，提高油菜生产效益。由于我国尚未批准转基因抗除草剂油菜品系的生产种植，导致我国抗除草剂种质资源有限，近年来油菜抗除草剂种质创新已经成为油菜育种的重要目标之一[9-14]，但目前可用于生产的非转基因抗除草剂油菜杂交品种鲜有报道，因此，选育抗除草剂pol CMS恢复系对培育抗除草剂pol CMS“三系”品种具有重要的意义。

M342为江苏省农业科学院经济作物研究所采用EMS诱变获得的抗磺酰脲类除草剂种质资源，其BnALS3基因序列发生了单碱基突变，第574处的氨基酸由Trp突变成Leu，导致M342具有较强的磺酰脲类除草剂抗性，且该突变基因遵循1对显性基因的遗传模式[14];研究表明，pol CMS恢复基因也为1对主效显性基因[16];因此，采用杂交转育的方法聚合M342中的抗除草剂基因及pol CMS恢复系中的恢复基因在理论上仅有1/16的概率，选育过程工作量较大。利用M342来源的抗除草剂基因为显性基因的特性，本研究在F2分离群体对单株进行苯磺隆除草剂处理，杀死不抗除草剂单株，缩小了选育范围;此外，利用M342选育单位开发的分子标记[15]，对213个F2抗除草剂单株进行了标记辅助选择，获得了纯合抗性单株67株，大大减少了选育的田间工作量。在pol CMS恢复系选育中往往对稳定自交后代测恢以筛选携带纯合恢复基因的单株[17]，但这种方法需要较大的自交后代群体，具有一定的随机性，而本研究在F2代就对单株进行测恢，可以提前筛选携带纯合pol CMS恢复基因的单株，具有较强的目标性。采用这套方法，成功选育了抗除草剂的pol CMS恢复系18Z363，表明该方法可以为选育其它遗传背景的抗除草剂pol CMS恢复系提供参考。

杂交转育是作物遗传育种的基本方法，可以利用具有不同性状的亲本配制杂交組合，在分离后代中定向选育，实现不同性状的聚合[17]。本研究选育的18Z363实现了pol CMS恢复基因与除草剂抗性基因的聚合，其它农艺性状调查发现18Z363遗传了2350C的主序角果数多、主序结角密度高、单株有效角果数多等优点。由于亲本M342来自长江下游油菜生产区，其生育期较长，不适合贵州地区的生态环境，而选育的18Z363的生育期相对于M342有所缩短，表明本研究在18Z363的选育过程中对早熟性进行定向选育有一定的效果。18Z363的每角粒数和千粒重性状接近母本2350C而显著低于M342，杨玉花等[19]研究认为油菜角粒数受母体效应影响较大，因此18Z363的每角粒数较低可能是由母本2350C的角粒数较低造成的;甘蓝型油菜千粒重性状同时受到基因的加性效应和显性效应共同作用，以加性遗传效应为主[20]，选育高千粒重材料需要利用高千粒重品种（系）做杂交亲本， 利用主基因和多基因的加性效应来选育高千粒重后代[21]，可见千粒重改良比较复杂，需要系统的定向选择，而本研究在18Z363的选育过程中重点关注了其除草剂抗性及pol CMS的恢复性，未为对其千粒重性状进行系统选择，导致其千粒重没有提高。

采用18Z363与本单位选育的pol CMS不育系配制了11个组合，喷施苯磺隆除草剂鉴定发现11个杂交组合表现为抗除草剂，表明可以利用该恢复系培育抗除草剂的品种。组合产量鉴定发现11个组合中有1个组合的产量显著高于油研50，2个组合与油研50产量持平，而油研50是贵州省审定和国家审定品种，具有较好的丰产性[22]，可见18Z363在配制高产组合中具有一定的潜力。对组合的农艺性状调查发现高产组合（J068A×18Z363、LDX380A×18Z363、LDX6-18A×18Z363）及油研50的一次分枝数、主花序较长、主花序角果数、单株角果数、每角粒数及单株籽粒产量等性状不同程度地高于低产组合（LDX92-11A×18Z363、LDX374A×18Z363、LDX82-11A×18Z363），表明在选育恢复系时应着重选育一次分枝数、主花序较长、主花序角果数、单株角果数、每角粒数及单株籽粒产量等性状配合力高的材料。

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作者简介：

张超（1985-），男，硕士研究生，助理研究员。研究方向：油菜遗传育种。