固相亲合载体应用于中药复杂体系直接作用靶点研究的现状与挑战

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[摘要] 中药是由多种化学成分构成的复杂体系，其发挥疾病治疗作用的最大特色就在于其所含的多种活性成分通过多靶点协同作用得以实现。以往针对中药的药理机制研究大多关注于对单一信号通路的检测或是对整体蛋白质组学变化的表型分析，尚无有效方法针对中药的直接作用靶点开展研究。因此无法从靶点源头上解析中药的分子作用机制，难以科学诠释其传统功效，进而严重影响其临床应用和国际化推广。该文主要针对中药复杂体系的直接作用靶点（群）的鉴定进行初步的方法学探讨，提出了基于光敏偶联技术的中药化学成分固相亲合载体的制备及靶点蛋白富集和鉴定策略，并在此基础上探讨了该策略的优势和局限性，同时针对今后的发展方向和有待解决的问题提出了新的见解。希望对于从事中药药理学研究特别是中药靶点确证的相关人员具有一定的指导和借鉴意义。

[关键词] 中药； 复杂体系； 靶点； 药理机制； 光敏微球

[Abstract] Traditional Chinese medicine（TCM） is a complex system with multiple chemical compositions The most significant character of TCM is that the chemical compositions interact with each other by multitarget synergism to treat diseases Previous reports mainly focused on the investigation of single signaling pathway detection or the phenotypic analysis of proteomics difference； however， no studies have been conducted on the identification of direct targets of TCM Therefore， it is difficult to analyze the molecular mechanism of traditional Chinese medicine from the target source， and it is difficult to explain its traditional efficacy scientifically， thus seriously affecting its clinical application and internationalization In this article， we discussed the methodology for the identification of direct TCM targets（groups）， and presented the strategy for preparation of TCM chemical composition solid coupling beads， as well as of eichment and identification strategy of target proteins based on photosensitive coupling technique We also discussed the advantages and limitations of this strategy， and put forward some new ideas for the future developments We hope this article can provide some guidance and reference significance for the researchers on TCM pharmacology study， especially on target identification.

[Key words] traditional Chinese medicine； complex system； drug target； pharmacological mechanism； photosensitive beads

中药在我国的使用历史悠久，长期积累了大量的临床经验，防病治病效果明确，因此在维持人们健康方面做出了巨大贡献。但是时至今日中药的使用和推广还主要局限于中国、韩国、日本及东南亚地区，其国际化和现代化的步伐缓慢，特别是在欧美等发达国家的推广和应用还受到不少的限制。究其根本，主要问题还在于中药的成分十分复杂，药理机制难以说清，药物靶点不明，因此难以使用现代科学语言对其药理作用和传统功效进行精准的诠释^[1-2]。

近年来，关于如何研究和理解中藥复杂体系药理机制的探讨一直在不断进行，就此人们也提出了很多理论与假说。比如较为流行的中药“多成分、多靶点”观点认为，中药由于其所含化学成分复杂多样，因此每种化学成分都有各自的作用靶点，多个成分对应多个不同靶点，由此构成了中药复杂体系的多成分、多靶点的作用模式^[3-4]。该观点可以很好的解释中药成分多样性所导致的作用机制复杂性的现象，同时也契合了不少实验结果，因而已经成为目前中药药理学研究的重要模式之一。然而，近年来也有人提出中药成分虽然复杂，但是未必一定是多成分、多靶点的看法。即中药里所含的多个化学成分可能同时作用于1个靶点，而1个化学成分也可能同时作用于多个不同靶点的现象是存在的，甚至有时单一化学成分作用于多个靶点的现象在中药里更为常见^[5]。这一观点近几年来也催生了一个新学科的出现，即多重药理学（polypharmacology）^[6]。有学者认为，具有多重药理作用的中药活性分子由于其作用于疾病网络中的多个靶点，多个靶点之间产生协同作用，进而导致综合作用大于单个作用加和的效果，这可能更加有助于诸如心脑血管疾病、肿瘤、代谢性疾病及神经退行性疾病等多基因复杂疾病的治疗^[7]。值得一提的是，新近还有学者针对中药成分复杂性的特点提出了中药复杂体系的 “显效理论”，认为中药活性成分可能通过“众多显效形式的单靶点叠加作用、多靶点协同作用”发挥整体药效，同时各种中药活性成分由于作用靶点的不同还可能产生“毒性分散作用”，进而削弱中药自身的毒性^[8-9]。由此可见，这些观点和理论的不断提出，为中药复杂体系的药理机制研究与阐释奠定了坚实的理论基础和思想框架。因此有必要开展大量的实验研究去验证、支持和进一步丰富这些研究理念，从而使中药复杂的药理作用机制得以真正的阐明，并最终促进中药的国际化。

1 中药复杂体系分子靶点研究的迫切性

近年来，随着青蒿素研究获得诺贝尔奖及中医药研究热潮的复兴，大量研究机构开展了针对诸多经典名方的药理机制研究，致使一大批传统中药方剂的功效得到循证医学的确认，作用机制也得到更深刻的认识。但是目前存在的主要问题是大多研究仅针对中药方剂作用于细胞或机体后的所引起的整体蛋白质组、转录组以及基因组表达变化的表观性研究，未能通过这些表观信号指标的变化找到药物分子的直接作用靶点，因此尚未真正意义的阐明药物的分子作用机制。特别是面对像中药这样具有多种化学成分的复杂体系，其直接作用靶点或靶点群的研究更是困难，因此严重制约了中药传统功效的科学诠释及现代化进程。

众所周知，靶点是药物作用于细胞和机体并产生疾病防治作用的生物学基础，是药物作用的源头。只有弄清药物分子的作用靶点并了解其生物学功能后，才能真正从根本上阐明该药物的分子药理机制，并进而指导临床精准用药^[10]。一般来讲，药物的靶点就是人体内的某些生物大分子，诸如蛋白质、核酸或糖类物质等。药物通过靶向作用于这些生物大分子，调节其生物学活性，进而引起靶点分子下游的细胞信号通路的改变，进而扰动疾病网络，发挥疾病治疗和预防的作用^[11]。因此，药物靶点的阐明和揭示，可以从源头上弄清药物的作用机制，对于全面认识和理解药物具有重要的指导意义。

2 中药复杂体系分子靶点研究现状

目前，针对中药分子靶点的研究尚未形成统一的思想框架。早期的探索性研究可能主要源于针对单一天然活性分子的作用靶点鉴定。比较知名的案例就是针对天然产物FK506的作用靶点蛋白FKBP的揭示，该研究是由哈佛大学的Schreiber教授领导完成的^[12]。此后逐步掀起了一股天然活性分子靶点的研究热潮，包括紫杉醇^[13]，喜树碱^[14]，吗啡^[15]，石杉碱甲^[16]以及三氧化二砷^[17]的分子靶点相继被发现。由此逐渐形成了一套较为成熟的天然活性分子的靶点研究策略，即“靶点垂钓”技术^[18-19]。该技术主要是通过化学修饰在原有分子结构中引入一个标签分子，如生物素分子，进而利用生物素与固相载体表面的亲和素之间的强相互作用，将与分子探针特异性结合的靶点富集到固相载体表面，并通过高分辨质谱对靶点进行鉴定。应用该技术进行药物靶点确证时，需要对所研究的活性分子进行化学修饰，修饰过程中不能破坏该分子原有的药效团，即合成的分子探针要保留原有的生物学活性，因此这一要求十分苛刻，并不适用于所有天然活性分子的靶点研究，因为很多天然活性分子没有可供修饰的化学基团。因此，“靶点垂钓”技术仅适用于少数天然活性分子 [20]。

分子“靶点垂钓”技术对于单一分子的靶点研究尚且困难重重，其对于中药方剂这样复杂系统的靶点研究就更加无能为力。如果采用研究单一活性分子靶点的思路开展中药复杂体系的多靶点鉴定与研究时，首先就需要将中药复杂体系中的整个化学成分全部偶联到固相载体上，进而才能进行后续的靶点富集与鉴定。而解决这一问题的关键就是如何将中药所含的诸多不同结构的化学分子偶联到固相载体上，采用传统针对单一化学分子进行结构修饰进而引入标签分子的策略显然是行不通的。因此，近年来人们不断开发出了一些基于其他技术手段的中药作用靶点研究策略。

2.1 基于计算机虚拟对接技术的中药寻靶方法 多年以前人们已经开始采用基于计算机虚拟对接技术的反相寻靶方法。通过首先明确中药复杂成分体系中的主要活性成分，进而将他们的化学结构输入计算机系统，依托后台的靶点蛋白结构库及分子对接软件平台进行虚拟分子对接，寻找与中药活性分子对接打分较高的潜在作用靶点，最后将中药活性分子对接得到的靶点进行汇总，即得到该中药的作用靶点（群）。根据靶点群中不同靶点的生物学功能，还可以绘制靶点互作网络，进而解释中药的复杂分子药理机制^[21-22]。然而，该研究策略存在一个明显的不足，即研究结果需要后期的实验验证，而这一验证工作量很大，对于一些条件受限的实验室有时甚至无法完成。

2.2 基于系统生物学的中药寻靶方法 近年来，随着系统生物学，基因组学和蛋白质组学技术的不断发展，人们又尝试采用各种组学技术来研究中药复杂体系的药理机制，特别是作用靶点。例如通过检测中药干预细胞或动物体系前后的整个蛋白质组水平的变化，进而通过各种生物信息学分析方法如GO基因功能注释和KEGG通路注释等，绘制药物可能调控的信号通路，这样沿着信号通路不断向上追溯就可以找到该药的作用靶点^[23-24]。例如有学者采用网络药理学等方法研究了中药麝香保心丸的潜在作用靶點及对心血管系统的信号通路及疾病网络的调控作用。结果发现麝香保心丸可能参与调控了523个不同的靶点蛋白，其中的28个入血成分对应了其中的113个靶点蛋白，包括COL1A1，MMP9，NOS3，TLR4以及VCAM1等。这些靶点之间通过相互协同作用，进而扰动疾病网络，发挥抗心肌缺血所致的心绞痛和心肌梗死等疾病治疗作用。对于像中药这种组成十分复杂的药物体系，基于组学的研究策略可以大大降低研究的时间，即在短期内即可找到与药物相关的作用靶点并阐明其药理机制。不过该方法也存在一些问题，即通过生物信息学计算找到的靶点可能仅是一些药物间接调控的靶点，可能并不是药物的直接作用靶点，因此有时还不能从源头上解释药物的分子药理机制，而目前针对该研究策略的不断完善仍然在进行中。

2.3 基于化学生物学的中药寻靶方法 通过化学生物学的手段开展复杂体系的药物靶点识别近年来已经有所报道。尤其是通过细胞热移位法（cellular thermal shift assay，CETSA）以及DARTS（drug affinity responsive target stability）技术开展的复杂体系药物靶点研究较为突出。例如，DARTS技术被用来研究葡萄籽提取物的潜在作用靶点蛋白，结果发现葡萄籽提取物能够靶向作用细胞内质网相关蛋白，例如GRP75，GRP78，HSP7c，ALDOA等，通过诱导内质网应激进而促进细胞内调控蛋白质翻译过程的蛋白表达下调，最终发挥抗肿瘤作用^[25]。另外，本课题组也在尝试使用细胞热移位法并结合活细胞稳定同位素标记技术（SILAC）进行复杂中药体系的寻靶研究，即通过对中药提取物处理过的活细胞进行热应激处理，然后通过SILAC定量蛋白质组学检测药物处理前后细胞中的蛋白稳定性变化，进而找到可能与中药提取物发生潜在结合的靶点蛋白。

3 基于固相亲合载体的中药复杂体系靶点研究策略

近几年来，随着光化学技术的不断进步，人们发现了一系列具有光敏活性的化学基团，如二苯甲酮和三氟甲基取代氮杂环丙烷这些光敏基团的特点是可在紫外光激发下活化成碳自由基，而碳自由基可以高效的插入到化合物的碳氢键之间，形成共价偶联^[26-27]。由于中药活性成分中大多具有碳氢键，所以如果将光敏基团键合到固相载体（如微球、芯片）的表面，进而可以利用光反应活化这些光敏基团，实现将中药活性成分偶联到固相载体表面的设想。基于该策略，可以将中药甚至整个方剂的所有化学成分整体键合到固相载体表面，并用于后续的靶点钩钓与鉴定。

本课题组前期基于该靶点钩钓策略研究并鉴定了多个中药方剂、单味药及其有效部位的作用靶点群。即将中药的全化学成分组或有效部位成分通过光活化偶联技术键合在固相磁性微球的表面，进而将被修饰的磁性微球与细胞或组织裂解液进行共孵育，通过固定在微球表面的中药化学分子与靶点之间的特异性相互作用，将不同的靶点富集到固相微球的表面，再通过特异性洗脱将靶点从微球表面剥离下来，进行高分辨质谱鉴定与分析，从而得到该中药化学成分组对应的靶点群（图1）。此外，基于鉴定得到的不同靶点，开展生物信息学分析，笔者进而发现了一系列与所发现靶点群相关的细胞信号通路，依据这些信号通路所反映的生物学功能进而推测了这些中药发挥药效作用的潜在分子药理机制。这种通过光偶联技术将中药化学成分组整体键合到固相载体表面，进而钩钓相应靶点，并依据生物信息学分析手段探讨这些靶点所反映的生物学功能及药理调控网络，进而诠释中药传统功效的策略在以往的中药研究中尚未见广泛报道。

该方法最大的特色在于其可以发现中药复杂体系的直接作用靶点，进而可以从靶点源头上解释中药的药理机制。此外，依据这一策略所揭示的是针对整个中药化学成分组的靶点群，因而体现了中药的整体作用特点。更值得一提的是，依据该方法还可以通过将不同中药活性成分或同一中药的不同活性分子分别偶联到不同的微球上，分别钩钓其对应的靶点并与总方的作用靶点群进行比较，进而研究同一方剂内部不同药物之间的配伍关系，或同一中药的不同活性成分之间的协同作用，进而深入揭示中药调控机体发挥疾病治疗作用的复杂药理机制。

4 基于固相亲合载体的中药复杂体系分子靶点研究所面临的问题及挑战

基于光偶联技术构建中药化学成分亲合载体并进行分子靶点鉴定的策略目前还仅是针对某一中药或方剂的全化学成分组的靶点研究，这里尚未考虑到药物的体内吸收和代谢转化等因素的影响^[28]。由于中药的化学成分并不能被机体全部吸收入血，因此只有部分成分在体内可作用于其特定的靶点，此外由于药物经过体内代谢后可能部分原型化合物的结构发生了变化，因此其作用的靶点也可能随之发生变化，或该化合物针对某个靶点的作用强度亦随之发生变化。因此基于目前的研究策略所发现的作用靶点可能要多于中药在体内实际作用的靶点数。因此期待今后进一步结合中药的体内吸收和代谢特点进而有针对性的将中药吸收进入体内的化学组分筛选出来，并偶联到固相载体表面，这样鉴定得到的靶点将更加特异、更有针对性，更能真实的反映中药在体内的作用机制。另外值得注意的是，中药吸收入血后，还存在不同器官分布的特点^[29]，因此研究过程中可能要考虑到针对不同器官制备特异性的组织裂解液，同时针对进入某一特定器官的特定化学成分制备固相亲合载体，进而更加精准的开展中药靶点鉴定和研究工作。此外，笔者也在积极探讨是否可将用于偶联中药活性成分的固相磁性微球做的更小，比如达到纳米级别，这样可以直接将该微球通过注射方式进入体内，然后获取某一特定器官的裂解液，进而通过磁性富集的方式富集体内的磁性标记药物，并分析与药物结合的潜在靶点蛋白，即在体状态下直接开展靶点鉴定工作。

5 结语

目前针对中药活性成分单体的分子靶点鉴定方法已经十分成熟，但是如何鉴定中药特别是中药方剂等复杂成分体系的作用靶点的研究尚未广泛开展，其中的关键瓶颈就在于如何将中药复杂化学成分进行芯片偶联与固定，进而开展后续的靶点鉴定。除了基于光偶联技术外，目前还有一些其他方法处于尝试阶段，比如通过环氧活性基团与含糖环化学分子进行偶联^[30]以及物理性吸附^[31]等手段。但是這些方法均未引起广泛关注，因此有必要对此进行深入探讨，进而发现更多的针对中药复杂化学成分体系的多靶点研究策略，这些尝试将对今后中药分子药理机制研究具有十分重要的指导意义。

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[责任编辑 张宁宁]