G蛋白在信号转导中的作用 Ｇ－蛋白信号转导调节子４（ＲＧＳ４）基因多态性与精神分裂症的关联研究
时间：2019-01-18 04:35:03 来源：达达文档网 本文已影响 人 
【摘要】 目的：探讨G-蛋白信号转导调节子4 (regulator of G-protein signaling-4，RGS4) 基因与精神分裂症及临床症状的遗传关联。方法：应用病例对照关联研究设计，采用聚合酶链式反应－限制性片断长度多态性(PCR-RFLP) 和DNA测序方法，分析386例精神分裂症患者和390例正常对照者中RGS4基因4个单核苷酸多态性(SNP)位点与精神分裂症的关联。并采用阳性和阴性症状量表(PANSS)评估患者的临床症状，进一步分析PANSS因子分与RGS4多态性的关联。结果：RGS4基因的两个多态性位点rs12753561(T>G,χ�2=8.970,P=0.002)和rs10759（C>A,χ�2=13.773,F=0.002,P=0.002）与精神分裂症关联，由上述4个SNPs组成的多个单体型如AAGA(χ�2=11.120,P=0.0008,OR=0.52,95%CI=0.36-0.77)和GGGC(χ�2=10.096,P=0.001,OR=1.43,95%CI=1.15~1.79)均与精神分裂症关联。PANSS量表的阴性症状因子分与rs12753561(t=2.216,P=0.029)和rs10759(t=2.543,P=0.012)关联。结论：RGS4基因多态性与精神分裂症及阴性和一般精神病理症状显著关联。�
【关键词】精神分裂症；G-蛋白信号转导调节子4；关联研究�
中图分类号：R749.3，Q78文献标识码：A文章编号：1000-6729(2007)03-00181-05�
G-蛋白信号转导调节子4 (regulator of G-protein signaling 4, RGS4)基因全长约25.3kb，克隆定位于1q21-22，该染色体区域是Brustowicz等报道精神分裂症的连锁程度较高的区域(Lods=6.5)［1］。基于上述连锁研究发现，Chowdari等首次报道在美国匹兹堡高加索和印度人群中RGS4是精神分裂症的易感基因之一［2］，随后，Williams和Morris分别在英国和爱尔兰人群中重复了上述关联研究结果［3,4］。而基因表达和功能研究进一步为RGS4与精神分裂症的关联提供了证据，Mirnics等发现精神分裂症患者大脑前额叶RGS4的mRNA表达水平下降［5］。功能研究提示，RGS4蛋白可能通过负性调节G-蛋白偶联受体(如代谢型谷氨酸受体)，抑制谷氨酸、多巴胺等神经递质及其受体的相互作用，从而导致上述神经递质系统的功能异常［6,7］，上述神经递质系统的功能异常是精神分裂症的重要病理生理特征。因此，无论基因克隆定位、连锁和关联研究，还是基因表达、功能研究等，都提示RGS4基因可能是精神分裂症的一个重要候选基因。�
既往大多数有关RGS4基因的遗传关联研究，主要针对位于该基因5"上游和第一内含子约6.039 kb区域内的四个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，即SNP1 (rs10917670), SNP4 (rs951436), SNP7 (rs951439)和SNP18 (rs2661319) (dbSNP数据库），但由于种族差异、人群分层、检测和分析方法的不同，各研究小组之间甚至同一研究小组不同研究对象之间所得研究结论不尽相同，难以彼此重复。如Chowdari在高加索人群、Morris在德国人群中，均检测到由上述四个SNPs组成的精神分裂症关联单体型为GGGG，而Chowdari和Williams分别报道印度和英国人群中精神分裂症关联单体型为ATAA。�
本研究选择既往关联研究所报道的阳性关联结果重复性较好的两个SNPs，位于RGS4基因上游的SNP1和SNP7，同时在第一内含子和第五外显子上另外选择两个杂合度较高(>0.4)的SNPs，在中国北方汉族病例对照样本中进行基因型检测和关联分析，旨在探讨RGS4基因多态性与精神分裂症及临床症状的关联。�
1对象和方法
1.1 对象病例组为2000~2006年在北大六院方便取样住院诊治的汉族精神分裂症患者386例，其中，男201例，女185例，平均年龄31±10岁，平均发病年龄26±6岁，平均病程为5.0±1.4年。对照组为年龄、性别均与病例组匹配的汉族健康对照者390例，男210例，女180例，平均年龄30 ± 8岁。�
依据国际疾病分类第10版(ICD-10)精神分裂症的诊断标准，由两名以上精神科医师（其中至少1名是主治医师）独立诊断，诊断一致并排除其他精神科疾病。采用阳性与阴性症状量表(positive and negative syndrome scale, PANSS)［8］评估精神分裂症患者的临床症状，参加PANSS量表评定的精神科医师于研究开始前接受培训，两医师评定一致性Kappa值>0.85，量表评定在患者入院后一周内完成，平均PANSS总分89.3±15.8。正常对照者来自北京市血液中心的献血者，经非结构式临床访谈排除精神疾病，且家族中无精神疾病及自杀者，个体间无血缘关系。所有研究对象均来自中国北方(秦岭-淮河以北)地区汉族人群，均无严重躯体疾病。所有研究对象均于入组前详细了解本研究的目的和程序，并签署知情同意书。本研究已获得北京大学医学部伦理委员会的批准。�
1.2 方法�
1.2.1 基因组DNA提取抽取所有受试者外周静脉血5ml，置于EDTA抗凝管中，混匀后保存于4°C冰箱，一周内用上海华舜生物工程有限公司的小量血液基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，-70℃保存待用。�
1.2.2 基因型扩增采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction - based restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)和DNA测序方法检测所有研究对象的四个SNP的基因型［SNP1 (rs10917670), SNP7 (rs951439), rs12753561, rs10759］共18.12kb的区域。检测PCR引物、退火温度(Tm)、限制性内切酶等部分信息参见Chowdari等的报道［2］。�
1.2.2.1 PCR-RFLP25μl的PCR扩增反应体系：10mM Tris-HCl (pH 8.3), 50mM氯化钾, 1.5mM氯化镁，200μM dNTPs，0.4μM引物，30-50 ng基因组DNA，1单位Taq DNA聚合酶。PCR扩增反应条件：94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，55-59°C退火30秒, 72°C延伸1分钟，共35个循环，最后72 ℃后延伸10分钟。对于SNP1( rs10917670)和SNP7 (rs951439)，分别在15μl PCR产物中加入2 U 限制性内切酶BstN I和Dde I及2μl酶切缓冲液，置于37℃孵箱过夜消化反应。取6-8μl酶切产物，用3%琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，经溴乙锭染色、凝胶成像系统扫描后读取基因型。�
1.2.2.2 基因测序对于rs12753561和rs10759，取20μl的PCR产物经PE Biosystem公司生产的含AmpliTaq DNA聚合酶荧光标记测序试剂盒(BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)纯化，内引物扩增，采用Applied Biosystem公司生产的ABI PRISM 377-96 DNA测序仪检测。�
本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 1.3 统计分析采用SHEsis遗传分析软件［9］进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验、连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)、单位点和单体型(haplotype)遗传关联分析，分别比较病例组与对照组各SNPs的基因型和等位基因(卡方检验)以及单体型的频率差异，并对上述遗传分析结果分别采用Bonferroni校正(显著性水平为单位点α值/位点数)和基于100次样本对换的置换检验(resampling- based permutation test)，以消除多重假设检验时可能产生的假阳性误差。
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2结果
2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验
表1精神分裂症病例组与正常对照组RGS4基因各SNP位点基因型及等位基因频率比较，n(%)�
SNPs病例组�(N=386)对照组� (N=390)χ�2值P值OR�b (95%CI)
各位点等位基因的优势比(Odds ratio, OR)是依据两组间罕见等位基因与常见等位基因比值计算的。�
所有四个SNP位点的基因型频率经Hardy-Weinberg遗传平衡检验，病例组和对照组各多态性位点的观察值和预期值之间均无显著性差异（P>0.05），表明该研究对象来自大的群体，个体间为随机婚配，无明显的自然选择、迁移等因素对遗传平衡的影响，资料可靠。�
2.2 单位点遗传关联分析�
各位点基因型和等位基因的频率分布见表1。SNP1 (rs10917670)和SNP7 (rs951439)的基因型和等位基因的频率在病例组和对照组间无显著差异(P>0.05)。其他两个SNPs基因型和等位基因在病例组和对照组间的差异均存在显著性，rs12753561 (等位基因: T>G, χ�2=9.038,P=0.002, OR = 1.37, 95%CI =1.11-1.69; 基因型: χ2 =13.197,P=0.003)和rs10759 (等位基因: C>A, χ2 =13.197, P=0.0002, OR=1.45, 95%CI =1.18-1.77; 基因型: χ�2 =15.013, P=0.0005)。经Bonferroni校正，上述差异仍存在统计学显著性。�
2.3 连锁不平衡分析及单体型遗传关联分析�
为了解各遗传标记位点间的连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)情况，我们对四个SNP位点进行了相邻位点间的LD分析，结果表明，D"为0.655~0.879，提示四个SNP位点之间存在中等程度以上的LD(表2)。��
对四个SNP位点分别进行2、3、4个位点构成的单体型分析，结果表明病例组与对照组间多个单体型的估计频率差异存在显著性，如A-A-G-A: χ�2 = 24.584,P=7.11×10(-7), OR = 0.37, 95%CI = 0. 25-0.55; G-G-G-C: χ�2 = 18.938, P= 1.37×10(-5), OR = 1.74, 95%CI = 1.35-2.23(表3)。上述结果经置换检验，P值仍具有统计学显著意义。
2.4 风险等位基因与临床症状及发病年龄的关联分析�
对两个阳性关联位点rs12753561和rs10759，分别依据是否携带风险等位基因，将精神分裂症患者分为两组，进行临床症状评分及发病年龄的比较，结果发现，这两个多态性标记位点的风险等位基因与阴性症状显著关联(rs12753561: GT+TT > GG, t=2.216, P=0.029; rs10759: AC+CC > AA,t= 2.543,P=0.012)，但与发病年龄无显著关联(P> 0.05)(表4)。
3讨论
本研究选取既往研究报道阳性关联重复性较好的位于RGS4基因5"上游和第一内含子的两个SNP位点［SNP1(rs10917670), SNP7(rs951439)］，以及位于RGS4第一内含子和第五外显子上的两个SNP位点(rs12753561和rs10759)，在386例中国北方汉族精神分裂症患者和390例匹配正常对照者中，进行上述多态性位点的基因型检测，并进行遗传关联分析。�
与Chowdari等几项既往研究［3-5］不同，本研究采用病例对照关联研究，没有能够检测到RGS4基因上游SNP1和SNP7与精神分裂症的关联。无独有偶，Zhang等采用核心家系(精神分裂症患者及其生物学父母)关联研究，也未能在中国汉族精神分裂症核心家系中检测到SNPs1、4、7、18及其单体型与精神分裂症的关联，但他们在苏格兰精神分裂症病例对照样本中，发现SNP7与精神分裂症显著关联［10］，提示该基因多态性与精神分裂症的关联可能存在一定的种族差异。�
本研究采用DNA测序检测方法，发现位于RGS4基因第一内含子的rs12753561和第五外显子的rs10759与精神分裂症显著关联，进一步分析发现，这两个多态性位点的风险等位基因与精神分裂症的阴性症状显著关联，提示RGS4基因遗传变异可能在一定程度上增加了精神分裂症的易感性。但由于本研究发现的阳性关联位点与既往研究不同，且既往报道关联程度较高的四个SNPs及其单体型在本次病例对照研究和Zhang的家系研究(中国汉族人群)中都没有得到阳性关联结果，这也在一定程度上限制了本研究结果的临床意义。由于RGS4基因上没有杂合度较高的功能位点，目前有关RGS4基因的关联研究多关注5"和3"端可能具有潜在调控意义的多态性位点。基于上述研究发现，推测RGS4基因可能存在多个变异位点，它们对精神分裂症的发病具有潜在的不一致的贡献作用。�
尽管RGS4蛋白质在中枢神经系统中广泛表达，但RGS4对中枢神经系统的发育和功能调节作用机制仍没有阐明［11］。动物研究提示，RGS4可能参与了G蛋白偶联受体的功能调节，进而调节多巴胺、去甲肾上腺素、谷氨酸、γ-氨基丁酸以及其他神经递质的神经传递功能［11,12］。近年来有多篇权威综述提出，RGS4与NRG1、G72等多个精神分裂症易感基因，都可能通过影响NMDA受体调节的谷氨酸能神经递质传递功能，进而导致高级大脑皮层的神经微环路紊乱，引发精神分裂症等神经发育障碍的认知和行为紊乱［13,14］。�
本研究没有发现RGS4基因多态性与精神分裂症发病年龄的关联，所检测到的显著性水平最高的单体型AAGA在精神分裂症患者中的频率低于正常对照组，即该单体型可能对精神分裂症发病具有潜在的保护作用，提示RGS4基因多态性与精神分裂症的关联及该基因的潜在病理意义仍涉及其他潜在的混杂因素，有关RGS4与精神分裂症的关系需要进一步的功能研究线索佐证。
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