【滋肾解毒中药对Ⅳ型狼疮肾炎血清诱导肾小球系膜细胞Ⅳ型胶原核酸表达的影响】 狼疮肾炎

　　摘 要：目的：观察滋肾解毒中药对Ⅳ型狼疮性肾炎（LN）血清干预下肾小球系膜细胞（GMC）中Ⅳ型胶原（Col Ⅳ）mRNA表达的影响，从细胞分子生物学水平探讨滋肾解毒中药治疗LN的机制。方法：结合血清药理学方法，分空白对照组、对照组血清+15%LN血清组、低、中、高浓度含药血清+15%LN血清组5组观察，RT-PCR检测GMC中Col ⅣmRNA的表达。结果：含药血清可明显抑制GMC中Col ⅣmRNA的表达，以高浓度组最显著。结论：滋肾解毒中药的含药血清在15%Ⅳ型LN患者血清诱导下可明显抑制Col ⅣmRNA的表达，从而抑制GMC增殖和细胞外基质积聚，这可能是滋肾解毒中药治疗LN的分子机理。�
　　关键词：滋养肾阴法；清热解毒法；狼疮性肾炎；肾小球系膜细胞；Ⅳ型胶原
　　中图分类号：R259.932.42文献标识码：A
　　文章编号：1673-7717(2008)05-0922-03�
　　Research on Effects of Method of Invigorating Kidney�
　　Heat-clearing and Detoxicating (IKHD)on Collagen IVmRNA Expression of �
　　Glomerular Mesangial Cell Induced by Type-IV LN Patients Serum
　　�
　　LIU Xue�yao�1,LI Yan�2,LIU Ya�min�2，ZHANG Qiu�lin�3,SHI Cheng�jun�4�
　　(1.Department of Nephrology,Futian District TCM Hospital of Shenzheng,Shenzhen 518034,Guangdong,China;�
　　2.First Affiliated Hospital to Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510100,Guangdong,China;�
　　3.Liwan Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510120,Guangdong,China;�
　　4.Zhongshan University,Guangzhou 510130,Guangdong,China
　　)
　　Abstract:Objective:To observe the effects of Chinese crude drug of Invigorating the Kidney, Heat-clearing and Detoxicating (IKHD) on collagen Ⅳ(Col Ⅳ)mRNA expression of glomerular mesangial cell(GMC) induced by type-Ⅳ Lupus nephritis(LN). To explore the mechanism of the method of IKHD on the level of cell and molecular biology. Methods:With the method of blood serum pharmacology, 5 groups were observed: blank, control serum + 15% serum of type-Ⅳ LN patients, low, medium and high concentration serum which contained Chinese medicine of IKHD + 15% serum of type-Ⅳ LN patients. The method of RT-PCR was used to detect expression of Col ⅣmRNA.Results:Different concentration serum containing traditional Chinese medicine of IKHD could inhibit the expression of Col ⅣmRNA. The effect of high concentration serum was the most notable.Conclusion:Being intervened by the 15% serum of type-Ⅳ LN patients, the serum containing traditional Chinese medicine of IKHD can inhibit the expression of Col ⅣmRNA. Through this, it may inhibit the proliferation of GMC and the accumulation of extracellular matrix (ECM).This may be the molecular mechanism of TCM of IKHD curing LN.
　　Keywords:method of invigorating the kidney;method of heat-clearing and detoxicating;Lupus Nephritis (LN);glomerular mesangial cell (GMC);collagen Ⅳ
　　�
　　笔者前期实验观察到：Ⅳ型狼疮性肾炎（LN）患者血清具有明显的促进正常人肾小球系膜细胞（GMC）增殖的作用，以15%Ⅳ型LN血清最为显著。本研究观察临床上治疗狼疮性肾炎（LN）有较好疗效的滋肾解毒中药（方药组成：生地黄15g，知母10g，白花蛇舌草20g，红紫草20g，鱼腥草20g，怀牛膝15g，丹参15g，赤芍10g，益母草20g，甘草5g），对体外培养的Ⅳ型LN血清干预下肾小球系膜细胞（GMC）增殖、凋亡的作用。本研究将在前期实验的基础上，观察滋肾解毒中药对Ⅳ型LN血清干预下GMC中Ⅳ型胶原（CloⅣ）mRNA表达的影响，藉以从细胞分子学水平探讨滋肾解毒中药治疗LN的作用机制。�
　　
　　1实验材料
　　
　　正常人GMC：中山大学第一附属医院肾科实验室馈赠。1640培养基及胎牛血清（FCS）（GIBCO BRL公司）；DNA分子标准：DL2000 Marke（大连宝生物公司）；RNA提取试剂：Trizol（ Invitrogen公司产品）；RT-PCR试剂：逆转录酶系及Taq酶系（北京索奥公司产品），DNTPs（上海生物工程公司产品），DEPC（美国Sigma公司产品），RNasin（美国Promega公司产品），Phototope-HRP Western Blot Detection System 及Hoechst 33258（Cell Signaling公司），碘化丙啶（PI）（Cell Signaling公司），普通胰岛素（沈阳济世制药公司），D-Hanks液、0.02%EDTA、0.25%胰蛋白酶（实验室配制）。�
　　
　　2方 法�
　　
　　2.1 正常人GMC培养
　　将GMC离心，加15% FCS RPMI 1640培养液及0.66U/mL RI后加入细胞培养瓶，CO�2恒温培养箱培养。细胞融合80%以上时，0.25%胰酶消化、传代。�
　　2.2 大鼠含药血清制备
　　清洁级SD大鼠10只，体重（200±20）g，按简单随机化原则分为2组。A、B组分别以滋肾解毒中药浓缩液、饮用水各1.875mL/100g灌胃，日1次，共14天。乙醚吸入麻醉，腹主静脉无菌取血。分离血清，备用[1]。�
　　2.3 GMC中纤维连接蛋白（FN）mRNA表达的检测�
　　2.3.1 GMC细胞总RNA的提取
　　取传代至足够数量的GMC，用胰蛋白酶消化计数，铺于96孔板（每孔4000个），加入15%FCS1640液；待细胞贴壁48h后，换无血清培养液同步24h；换5%FCS1640液于96孔板，在加入刺激物时分为5组：1组(空白对照组) 、2组（B组大鼠血清+15%LN血清）、3、4、5组分别为A组低、中、高浓度含药血清+15%LN血清。
　　收集12、24、36、48h培养的GMC，每组分别3复孔。细胞总RNA的提取：胰酶消化细胞，PBS洗3次后转入1.5mL灭菌离心管；在标本中加入1mL的Trizol，充分振荡混匀，于15～30℃放置5min；加入200μL氯仿/mL Trizol，剧烈振荡，放置2～3min，12000r/min、4℃离心15min；将上层水相层转到新的离心管，加入异丙醇500μL/mL Trizol，放置10min，12000r/min离心10min，弃上清；用1mL 75％乙醇洗1遍，空气中晾干。加入50μL的灭菌DEPC水溶解；取5μL稀释100倍测OD260和OD280值，计算OD260/OD280。根据《分子克隆实验指南》：1OD值相当于40μg/mL的RNA。计算出RNA的含量（μg/μL）。取5μL用0.8％琼脂糖凝胶电泳。其余RNA放置－80℃冻存备用。�
　　2.3.2 逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR） MMLV逆转录成cDNA。分别加入FN及β-Actin引物，PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，用FR-200生物电泳图像分析系统摄影、Bandscan 5.0软件分析产物光密度，进行FNmRNA及β-Actin mRNA表达分析，并计算FNmRNA/Actin mRNA比值。
　　①引物序列：
　　应用生物信息学知识，从Genebank中查阅出Col Ⅳ及内参基因β-actin的mRNA序列，根据引物设计原则，并利用Primer Express2.0设计软件，设计出扩增各基因片段的引物。引物序列见表1。�
　　
　　②cDNA合成：
　　将反应体系（RNA 2μg、下游引物15pmol、DEPC水使最终反应体积为25μL）在70℃预变性5min，立即放于冰上，加入5×RT Buffer 5μL，10mmol dNTPs 1.5μL，RNasin 25U，M-MLV 200U；反应条件：37℃ 1h，95℃ 5min灭活逆转录酶。�
　　③常规RT-PCR扩增各基因mRNA：
　　反应体系：10×PCR Buffer 5μL，10mmoldNTPs 1μL，上、下游引物各15pmol，Taq酶3U，以上逆转录cDNA 5μL。加无菌去离子水至50μL。反应条件：93℃ 3min预变性，93℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 45s，共35个循环，72℃延伸10min。反应后检测，取8μL PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶进行电泳。�
　　2.4 统计学方法
　　数据以均数±标准差表示，计数资料用t检验、应用SPSS11.5统计软件进行统计分析。�
　　
　　3结 果�
　　
　　3.1 正常人GMC培养
　　相差显微镜观察：GMC属成纤维细胞型，胞体呈梭形或不规则星形及三角形，中央有一清晰的卵圆核，胞质向外伸出数个长短不一的突起。�
　　3.2 GMC中Col ⅣmRNA表达的检测
　　定量分析结果（n=6）显示，第1、2、3、4、5组FNmRNA/Actin分别为：0.146、0.452、0.276、0.208、0.169；与第2组比较，第3、4、5组的Col ⅣmRNA的表达量分别降低了38.94%、53.98%、62.61%。见图1～2。
　　
　　4 讨 论�
　　
　　4.1 新近发现LN患者血清中存在抗肾小球系膜细胞抗体的靶抗原
　　LN患者血清中本身就存在直接针对GMC的异质性自身抗体，各种抗肾小球系膜细胞抗体可以在肾小球系膜区形成原位免疫复合物进一步激活补体而使肾脏发生炎症反应[2-3]。�
　　4.2Ⅳ型LN（弥漫增殖型）炎性病变最为显著
　　在所有类型的LN中，Ⅳ型LN的炎性病变最为显著，光镜下几乎所有肾小球都有严重病变，出现广泛细胞增生和细胞浸润，许多细胞出现退行性变和核固缩[4-5]。�
　　4.3 GMC增殖 凋亡异常是LN的重要发病机制 GMC的体外培养是研究LN的重要手段之一
　　LN肾小球组织学改变为球内细胞数增多，基质堆积，并进行性发展，最终致肾小球硬化而致肾衰。GMC凋亡不足、过度增殖在LN的发病、特别是肾损伤中具有重要作用。GMC在体内生长调节受多因素影响，研究较困难，因此体外GMC培养已成为肾脏生理、病理研究（包括LN）必不可少的手段之一。但目前肾脏疾病的治疗药物对GMC的作用研究还限于正常人GMC的研究上，缺乏针对性[6-8]。�
　　4.4 Col Ⅳ的过度表达导致ECM积聚在Col的发生发展中起着重要作用
　　ECM积聚引起的进行性肾小球硬化与间质纤维化是各种原发性或继发性肾病包括LN的共同病理表现。在肾小球疾病中，ECM积聚是导致肾小球硬化的主要因素之一。Col Ⅳ是典型的基底膜胶原，是基底膜的支架结构，是基底膜中的主要胶原蛋白。它可由活化的GMC、内皮细胞、上皮细胞、肾小管上皮细胞等合成和分泌。故Col Ⅳ的合成和分泌增多及降解减少是行多肾脏疾病包括LN发展、ECM积聚、终至肾小球硬化和肾间质纤维化的重要原因之一，在LN时作为系膜基质主要成分的Col Ⅳ也会出现过度表达[9]。�
　　4.5 血清药理学方法为研究中药复方从细胞 分子水平提供了新的手段
　　血清药理学是一种公认的体内外结合研究中药药理作用的实验方法和技术，能较客观、真实地阐明中药的药效和机理。含药血清作用于体外培养的GMC，可最大限度地模拟体内环境。�
　　4.6 滋肾解毒法是治疗LN的主要治法
　　LN的主要病机是肝肾阴虚、热毒血瘀，因此，滋肾解毒以补其虚、泻其实成为治疗LN的主要治法，目前为多数学者所采用。在本处方中，生地清热凉血、滋阴生津，善清血分之热，怀牛膝补肾并导热而引血下行，二者共为君药；知母清热泻火养阴，为臣药；君臣合用，清火而壮水。白花蛇舌草、鱼腥草清热解毒；红紫紫草清热解毒、凉血活血；丹参、益母草调和诸药，为使药。诸药合用，共奏滋养肾阴、解毒活血之功。该组方思路符合LN的中医基本病因病机，也充分体现了辨病与辨证相结合的学术思想，应用于临床多年，证实能提高LN的临床疗效。�
　　4.7 本实验研究的理论依据及思路
　　目前肾脏疾病的治疗药物对GMC的作用研究还局限于正常人GMC的研究上，缺乏针对性。笔者前期实验研究发现，Ⅳ型LN患者的血清确实具有明显促进GMC增殖的作用，结果与正常血清组相比有非常显著性差异（P＜0.01），其中以15%Ⅳ型LN患者血清促进GMC增殖的作用最为显著，从而为肾脏疾病治疗药物对GMC的研究开辟了一个新的方法。因此在此基础上，笔者结合血清药理学方法，将临床上治疗LN取得较好疗效的滋肾解毒中药以大鼠含药血清与Ⅳ型LN患者血清共同作用于GMC，以观察其对GMC的增殖、凋亡和FNmRNA表达的影响，以期从细胞分子生物学水平探讨滋肾解毒中药治疗LN的机制。�
　　4.8 实验研究结果分析
　　对照大鼠血清与15%Ⅳ型LN血清共同作用于GMC后，GMC增殖明显增强，凋亡明显不足，FNmRNA的表达均明显增强。不同浓度含药血清与15%Ⅳ型LN血清共同作用于GMC，均能明显抑制GMC增殖，促进GMC细胞凋亡；且该作用呈明显的量效关系，浓度越高，抑制GMC增殖、促进GMC细胞凋亡的作用也越明显，以高浓度含药血清的作用最明显。含药血清还能明显下调FNmRNA的表达，且该作用也呈明显的量效关系，浓度越高，其抑制FNmRNA表达的作用也越明显，以高浓度含药血清的作用最明显。
　　综上所述，滋肾解毒中药可能通过抑制GMC异常增殖及并诱导其凋亡，抑制FNmRNA的表达进而抑制ECM过度积聚，从而抑制肾小球硬化、肾间质炎症细胞浸润以及免疫炎症反应等LN的增殖性病变，达到治疗LN的作用，值得进一步研究和临床应用。�
　　
　　参考文献�
　　［1］ 施新猷.现代医学实验动物学［M］.北京:人民军医出版社, 2000:335.�
　　[2] 裴斐,赵明辉,汪莺昱，等.狼疮肾炎中新发现的抗肾小球系膜细胞抗体靶抗原的鉴定［J］.中华医学杂志,2004，84(3):194-198.�
　　[3] 陈�,汪莺昱,赵明辉，等.狼疮肾炎患者血清抗系膜细胞抗体及其靶抗原的研究［J］.中华内科杂志,2003，42(12):851-853.�
　　[4] 王海燕.肾脏病学［M］.北京：人民卫生出版社,2001,2:421-430.�
　　[5] 叶任高,张道友,刘冠贤.红斑狼疮［M］.北京：人民卫生出版社,2003：1.�
　　[6] 刘志红,吴燕,周虹，等.不同增殖性肾炎细胞增殖与凋亡的关系［J］.中华肾脏病杂志，1997，13(6):334.�
　　[7] 潘晓勤,王晓燕,姜新猷.肾小球系膜细胞培养及鉴定［J］.南京医科大学学报,1995，15(1):222-223.�
　　[8] 王景明,孙奕,叶传蕙.肾衰宁灌肠液对体外培养的人肾小球系膜细胞增殖及产生纤维连接蛋白的影响［J］.中国中西医结合急救杂志,2000，7(6):353-355.�
　　[9] 杨政.Ⅰ、Ⅳ型胶原和肾功能疾病［J］.国外国医学•泌尿系统分册，2005，（25）5：78-83.