【游离脂肪酸诱导肾小管上皮细胞凋亡的实验研究】 肾小管上皮细胞
时间：2019-01-13 04:35:08 来源：达达文档网 本文已影响 人 
[摘要] 目的 探讨游离脂肪酸(FFAs)对大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)的凋亡作用及凋亡机制。方法 用含有不同浓度(0、125、250、500μM)软脂酸的DMEM-F12培养肾小管上皮细胞(NRK-52E),在24h、48h两个时段以原位末端标记(TUNEL法)检测细胞凋亡率,用硝酸还原酶法测定以上各组培养液中一氧化氮(NO)水平。在48h时段用免疫细胞化学法检测caspase-3表达水平。结果 随着软脂酸浓度的增高、作用时间的延长:①NRK-52E细胞的凋亡率逐渐增高,24h时三个软脂酸组按软脂酸浓度由低到高的凋亡率依次为(9.7±1.9)%、(14.2±4.5)%、(23.4±5.3)%,48h时为(16.2±3.7)%、(24.8±4.4)%、(35.4±5.7)%,与对照组相比均有统计学意义(P 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 1.2.2分组方法实验共设立五组(1)软脂酸干预组设三组:以去脂牛血清白蛋白(d-BSA)为溶解软脂酸的载体,以加入培养液中软脂酸浓度的不同分为125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L,(各组载体d-BSA含量为0.125%、0.25%、0.5%);(2)对照组设两组:①正常培养液组②0.5%d-BSA+正常培养液组。
1.2.3硝酸还原酶法分别测定NO常规消化、收集NRK-52E细胞,按每孔1×105接种于6孔培养板内,置37℃、5%CO2培养24h,换无血清培养液培养24h同步化细胞,加入不同浓度软脂酸继续培养,在0h、24h、48h时收集细胞培养液各100μL,-20℃储存用硝酸还原酶法测定各组NO含量。
1.2.4原位末端标记(TUNEL法)检测细胞凋亡水平按每孔1×105接种于放有盖玻片的6孔培养板内,置37℃、5%CO2孵箱细胞爬片培养24h,换无血清培养液培养24h同步化细胞后,加入不同浓度软脂酸继续培养,分别在24h、48h进行实验:先用PBS洗涤2次,加入4%多聚甲醛室温下固定30min,按照tunel凋亡检测说明书操作。再用苏木素轻度复染正常细胞,凋亡的细胞胞质浓缩、胞核固缩呈黄色,正常细胞形态正常胞核呈蓝色。从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。在400倍倒置显微镜下计数,凋亡率=凋亡细胞数/400倍视野中细胞总数×100%,每张片随机取9个视野,每个实验组观察5张片。
1.2.5免疫细胞化学法检测caspase-3按每孔1×105接种于放有盖玻片的6孔培养板内,置37℃、5%CO2孵箱细胞爬片培养24h,换无血清培养液培养24h同步化细胞后,加入不同浓度软脂酸继续培养,在48h进行实验:先用PBS洗涤2次,加入4%多聚甲醛室温下固定30min,PBS洗2次,蒸馏水洗3次,3%H2O2处理5min,蒸馏水洗3次,5%BSA封闭20min,甩去不洗加一抗4℃湿盒过夜,PBS洗3次,加二抗(生物素化羊抗兔IgG)37℃反应20min,PBS洗3次,加SABC37℃反应20min,PBS洗4次,DAB显色10~20min,苏木素轻度复染,蒸馏水洗。风干、封片。400倍倒置显微镜观察:细胞胞质成棕黄色者为阳性细胞。caspase-3表达率=阳性细胞数/400倍视野中细胞总数×100%,每张片随机取9个视野,每个实验组观察5张片。
2统计学处理
采用SPSS13.0统计软件,实验数据以均数±标准差(χ±s)表示,多个样本均数间两两比较采用单因素方差分析和q检验,两样本均数间比较行t检验。
3结果
3.1一氧化氮测定
见表1。表1显示,正常培养液组和d-BSA组培养液中NO浓度无明显升高,各软脂酸处理组在第24小时、48小时NO均明显增高,其中各软脂酸处理组与0h组相比,在第48小时表现出显著统计学差异(P0.05)。各软脂酸处理组细胞凋亡率明显增高,与正常培养液组和d-BSA组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。各软脂酸处理组细胞caspase-3表达率明显增高,且具有浓度依赖趋势,和48h时的细胞凋亡率基本一致,与正常培养液组和d-BSA组比较,差异均有统计学意义(P 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 [4] Yoshimichi Urahama,Yuki Ohsaki. Lipid droplet-associated proteins protect renal tubular cells from fatty acid-induced apoptosis[J]. Am J Pathol,2008,173(5):1286-1294.
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(收稿日期:2010-01-26)
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