白菊‘精诚’离体快繁技术研究

许颖妍 胡计红 杨惠婷

摘 要 以日本獨头白菊‘精诚植株的顶芽、带腋芽茎段为外植体进行离体快繁研究。结果表明：以0.1% HgCl2为表面消毒剂，最适消毒时间为5 min，初代培养中，顶芽的培养效果比带腋芽茎段更好；
以顶芽为外植体，初代培养的最适培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，其平均有效芽诱导数为5.87；
在增殖培养中，以带腋芽茎段诱导丛生芽，其最适增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA，增殖系数为6.92；
以叶片切段诱导不定芽，其最适增殖培养基为：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA，增殖系数为3.59；
以叶柄诱导不定芽，其最适增殖培养基为：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA，增殖系数为0.49；
最适生根培养基为：1/2MS+0.35 mg/L IBA，生根率100%。本研究结果可以为日本独头白菊‘精诚的工厂化生产提供技术支持，具有重要的实践价值。

关键词 日本独头白菊‘精诚；
芽诱导 ；

生根 ；
离体快繁

中图分类号 S336 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2019.02.008

Abstract In vitro rapid propagation of Japanese single-headed white chrysanthemum ‘Jingcheng was made by using apical buds and stem segments with axillary buds as explants. In primary culture， explants were best sterilized with 0.1% mercuric chloride as surface disinfectant for 5 minutes， and the apical buds had better culture results than the axillary buds. The optimal medium for culture of the apical buds was MS+ 0.5 mg/L 6-BA and 0.1 mg/L NAA， which induced 5.87 effective shoots by average. In proliferation culture， the shoots from the primary culture were cut into stem segments with axillary buds and induced to generate clustered shoots on the optimal medium of MS+1.0 mg/L of 6-BA+0.3 mg/L of NAA， and its multiplication coefficient was 6.92. The optimal medium for inducing adventitious shoots from the leaf was MS+1.0 mg/L of 6-BA+0.3 mg/L of NAA， and the multiplication coefficient of 3.59. The optimal proliferation medium for inducing adventitious shoots from the petioles of the leaves was MS+1.5 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA， and the multiplication coefficient was only 0.49. The optimum medium for root induction was 1/2 MS+0.35 mg/L IBA and the root inducing rate was upto 100%. These results will provide technical support for commercial production of elite seedlings of Japanese single-headed white chrysanthemum ‘Jingcheng， and has important practical value.

Keywords Japanese single-headed white chrysanthemum ‘Jingcheng；

bud induction；

root induction；

rapid propagation in vitro

切花菊是菊科（Asteraceae）菊属（Dendranthema）的多年生宿根草本花卉，既可盆栽观赏，又可作鲜切花生产；
切花菊的生产量占世界切花生产总量的30%，发展前景良好，具有很高的观赏价值和经济价值；
生产中常采用扦插繁殖，其繁殖系数低，易感染病菌并引起观赏品质退化，且繁殖成本高。组织培养的主要目的之一是提高繁殖速率，用于重要品种的无性繁殖与无病原植物的生产[1]，既可以在短时间内繁殖大量优质花苗，又可以使染病植株脱出病毒恢复原有的优良品质。

近年来，已有学者通过组织培养繁殖切花菊，进行工厂化育苗生产种苗降低种植成本[2]。福建省栽培的单头切花菊品种主要有‘白扇、‘神马和‘精诚。‘精诚是近年来从日本引进的单头切花白菊新品种，其花形花色更优，更耐寒，适合在福建省高海拔山区种植；
供花期在清明节前后，可以填补‘白扇和‘神马的市场空挡期。周婷[3]以‘白扇的顶芽和茎段为材料，建立了切花菊‘白扇的快繁体系；
张天静等[4]、张月娇[5]、邱美欢等[6]在建立‘神马组培快繁体系的过程中，均采用茎段作为外植体，能够直接诱导不定芽的产生。目前针对‘精诚的组培快繁研究，还未见相关报道。

本研究分别采用‘精诚的顶芽、带腋芽茎段、叶片、叶柄为材料，通过培养基配方的优化，直接诱导不定芽或丛生芽，提高繁殖系数；
通过生根条件优化，提高组培苗的生根率和移栽成活率。本研究旨在建立单头切花白菊‘精诚的组培快繁体系，打破优质种苗的国外垄断，为引进的优良品种产业化提供优质种苗。

1 材料与方法

1.1 材料

菊花[Dendranthema grandiflorum（Ramat）Kitam.]‘精诚插穗由厦门琴鹭花卉合作社提供。

1.2 方法

1.2.1 无菌系建立

将插穗切成长约2.5 cm的切段，用洗衣粉洗涤插穗，流水冲洗30 min，蒸馏水冲洗3次，每次10 min；
转至超净工作台，用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗1次，再用0.1% HgCl2分别浸泡3、5、7和9 min进行消毒，无菌水冲洗5次，每次10 min；
用滤纸吸干插穗表面水分，切掉底部与表面消毒剂接触的部分（约0.5 cm），将顶芽和带腋芽茎段分开接种于MS培养基中，每个处理接种25瓶，3次重复；
培养温度（25±2）℃、光照强度2 000 lx左右、光照时间12 h/d（以下培养条件相同），除特殊说明外，MS及1/2 MS培养基中均附加蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L ，pH 5.8～6.0。接种20 d后进行统计分析，计算污染率、死亡率、成功率，取平均值。

污染率=（外植体污染的个数/接种外植体总数）×100%

死亡率=（死亡的外植体个数/接种外植体总数）×100%

成功率=（外植体成活且未污染的个数/接种外植体总数）×100%

1.2.2 初代培养

剪取最适的外植体（顶芽或带腋芽茎段），接种于含不同浓度6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）和NAA（0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L）的MS培养基中，每个处理接种25瓶，每瓶接种1个外植体，3次重复；
接种后40 d统计高度大于2 cm的有效芽诱导数。

1.2.3 增殖培养

增殖培养均选取初代培养中长势较一致的无菌苗。茎段增殖培养：将无菌苗剪成1.5 cm左右的带腋芽茎段，接种于不同浓度6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L）组合的MS培养基中，每个处理接种25瓶，每瓶接种4个外植体，3次重复；
接种45 d后统计分析。

叶片增殖培养：取无菌苗顶端第1～2叶，将叶片切成0.5 cm×0.5 cm叶盘，叶背朝下，接种于不同浓度6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L）组合的MS培养基中，每个处理接种20瓶，每瓶接种3个叶盘，3次重复；
接种50 d后计算增殖系数。

叶柄增殖培养：取无菌苗顶端第1～2叶，切除叶片，保留叶柄，叶柄沟槽朝上，接种于6-BA（1.5 mg/L）和不同浓度NAA（0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L）组合的MS培养基中；
每个处理接种20瓶，每瓶接3个叶柄，3次重复；

50 d天统计分化率和增殖系数。

增殖系数=增殖后有效芽数/接种芽数。

分化率=（分化外植体总数/接种外植体总数）×100%

1.2.4 生根培养

选取继代增殖长势一致的无根苗，剪成3.5 cm长左右的插穗，接种于不同浓度的NAA（0、0.05、0.10、0.15 mg/L）或IBA（0、0.05、0.10、0.15 mg/L）组合的1/2 MS培养基中，每个处理接20瓶，每瓶接3个插穗，3次重复；
接种20 d后观察无根苗的生根情况，计算生根率。

生根率=（生根的植株数/接种的植株总数）×100%

1.3 数据分析

采用SPSS 17.0对数据用方差法进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 表面消毒时间对外植体的影响

如表1、2所示，消毒时间为3 min时，污染率最高，顶芽达到46.7%，腋芽达到50.2%；
消毒时间为5 min时，成活率最高，顶芽为91.6%，腋芽为86.7%；
消毒时间为9 min时，没有外植体污染，但由于消毒时间较长，0.1% HgCl2对顶芽产生毒害，导致成活率最低，顶芽为55.6%，腋芽为52.9%。所以，当选用顶芽或腋芽作为外植体时，0.1% HgCl2最佳的表面消毒时间为5 min。

2.2 初代培养中植物生长调节剂对顶芽诱导丛生芽的影响

以顶芽作为外植体，研究激素的浓度和配比对无菌芽苗诱导的影响。接种的外植体在第3天即可在切口处看到有浅绿色愈伤组织开始生成；
5 d后可以观察到顶芽开始萌发，外植体基部明显膨大，10 d后可观察到腋芽大量萌发（图1-A）；
第25天后无菌芽的生长速度逐渐变快；
第35 天后，丛生芽生长速度逐渐减慢。

如表3所示，高濃度6-BA（≥1 mg/L）和NAA（≥0.20 mg/L）组合的培养基，容易诱导出大量的愈伤组织；
当6-BA浓度大于1.5 mg/L，诱导的芽苗出现玻璃化或叶片畸形；
当6-BA浓度为0.5 mg/L，NAA为0.10 mg/L时，诱导的芽苗叶片浓绿、最健壮，有效芽最多（图1-B）。所以，以单头切花白菊‘精诚顶芽为外植体进行初代培养，最佳的初代培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA。

2.3 增殖培养中植物生长调节剂对带腋芽茎段诱导丛生芽的影响

据观察，无菌苗第3天外植体的基部会有黄绿色的物质产生，第7天茎尖向上生长，第15天基部有明显增大的愈伤组织（图2-A），茎尖伸长明显，在靠近基部的腋芽开始萌发，第25 天萌发出大量健壮丛生芽，生长缓慢，第30天可看到丛生芽生长速度逐渐加快，第45天过后，丛生芽逐渐停止向上生长（图2-B）。

如表4所示，处理3（1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA）长势好，叶片浓绿且增殖系数最大，均值为6.92；
处理1（1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）生长状况不好，增殖系数最低。所以，最佳的诱导丛生芽培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。

2.4 增殖培养中植物生长调节剂对叶片诱导不定芽的影响

在叶片诱导不定芽过程中叶片先脱分化形成愈伤组织，再分化产生不定芽。接种至培养基第3 天切口部位有膨大迹象（图3-A）；
7 d叶片四周向内卷曲形成愈伤组织；
15 d后愈伤组织萌发出不定芽；
20 d已萌发的不定芽长势良好；
30 d愈伤组织不再分化，大部分叶片萌发出不定芽（图3-B）；
40 d不定芽生长速度快，长势良好；
50 d不定芽逐渐停止生长。

如表5所示，处理1、2、6、和8均可直接诱导出不定芽，其中处理6大部分分化为不定芽，且不定芽强壮，长势好，叶片浓绿；
处理6的不定芽增殖系数最高，为3.59；
处理2的不定芽增殖系数最低，仅为0.44。所以，叶片诱导不定芽最佳的培养基配方为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。

2.5 增殖培养中植物生长调节剂对叶柄诱导不定芽的影响

在叶柄诱导不定芽过程中叶柄先脱分化形成愈伤组织，再分化产生不定芽。将叶柄接种至培养基配方为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA上，第3天叶柄切口部位有膨大迹象；
第 7 天愈伤组织开始形成；
第20 天愈伤组织为颜色逐渐变深，部分愈伤组织上开始萌发出不定芽（图4-A）；
第30 天愈伤组织颜色逐渐变黑，已萌发出的不定芽长势良好（图4-B）；
第50天产生的不定芽逐渐停止生长。如表6所示，4个处理均能脱分化出愈伤组织，但仅处理3（1.50 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA）能分化出不定芽；
在6-BA浓度为1.50 mg/L，NAA浓度为0.15 mg/L时，可以诱导出少量不定芽，增殖系数为0.49。所以，叶柄诱导不定芽的最适培养基为MS+1.50 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA。

2.6 在生根培养中NAA和IBA浓度对无根苗生根的影响

经观察发现，添加植物生长调节剂处理的茎段在接种后第4天即可观察到有根长出，接种15 d生根率均为100%（图5-A、5-C），而未加植物生长调节剂的对照，生根率95%。生根的无菌苗经过2 d炼苗后移栽进穴盘（图5-B）。如表7所示，综合平均生根数、平均生根长度、根的生长情况以及试验成本进行分析，最佳生根培养基配方为1/2 MS+0.05 mg/L IBA。

3 讨论与结论

在菊花组培快繁技术过程中需要保证外植体无菌，并在无菌条件下进行培养。外植体的消毒通常使用酒精、次氯酸盐、氯化汞，本实验采用0.1%氯化汞，消毒5min成功率达90%以上，这与张天静等[4]实验结果相同。在本研究中消毒3 min的外植体虽然是0致死率，但是此消毒时间可能不能杀死大部分的外植体表面和内部菌，所以污染率高；
消毒9 min时污染率为0但死亡率较高，可能在杀死菌类的同时也影响到外植体的活性。所以最适合的消毒时间为5 min，成活率达90%以上。

菊花的不同组织或器官均可作为菊花组培快繁的外植体，常用的外植体有顶芽、带腋芽茎段、花蕾、花瓣、叶片等[7-11]。钟海丰等[12]利用菊花‘绣球和‘妃子笑的幼芽和半木质化的茎段作为外植体建立组培快繁体系，试验表明幼芽比半木质化茎段更易诱导出有效芽；
周婷在‘白扇的组培快繁研究中发现，以顶芽和带腋芽茎段作为外植体诱导无菌苗时，顶芽比带腋芽茎段诱导出的无菌苗更多[3]。本试验在建立单头切花白菊‘精诚的无菌系时发现，顶芽比带腋芽茎段更适合作诱导无菌苗的外植体，这是由于顶芽内源激素水平高，活力强，同时生长点受到叶片保护，消毒时受到的伤害小，这和周婷[3]的研究结果相同。

细胞分裂素与生长素在菊花植株再生中也起着至关重要的作用[13]。在植物组织培养中，常用的细胞分裂素有6-BA、KT等，生长素多用NAA、IAA、IBA[14]。高浓度的植物生长调节剂会抑制无菌苗的产生，促进愈伤组织的生成，会提高变异的机率，还会导致无菌苗畸形、玻璃化[15]；
高浓度的细胞分裂素会导致组培中出现玻璃化现象[16]。本试验表明，高浓度的6-BA和NAA会诱导出大量愈伤组织，6-BA>1.5 mg/L时，诱导出的组培苗玻璃化和叶片畸形的机率也会增加。

以叶片和叶柄作为增殖培养的材料，直接诱导不定芽，可减少试验步骤和繁殖时间，节约试验成本。徐清燏[17]采用叶片作为外植体诱导不定芽；
蒋细旺等[18]采用不同菊花品种无菌苗的叶片诱导不定芽，结果表明，不同的品种叶片诱导出不定芽的能力有显著的差别；
张艳利[19]采用金盏菊生长期的叶柄诱导愈伤组织，结果表明，在激素6-BA和NAA共同作用下，愈伤组织分化效果较好；
陈雪鹃等[20]以芙蓉菊的叶柄为外植體，通过不同浓度的6-BA和NAA诱导愈伤组织，试验结果表明叶柄产生的愈伤组织难以诱导出不定芽，所以不是所有菊花品种都可以用叶柄诱导出不定芽。本试验采用添加6-BA和NAA的MS培养基诱导叶片和叶柄产生不定芽，叶片在6-BA 浓度为1.0 mg/L、NAA浓度为0.3 mg/L的MS培养基中，能诱导出不定芽，增殖系数为3.59；
叶柄在6-BA 浓度为1.5 mg/L， NAA浓度为0.15 mg/L的MS培养基中，能诱导出少量不定芽，增殖系数为0.49。

在MS 、1/2 MS、1/4 MS培养基中均能诱导无菌苗生根。李露华[21]、王丽华[22]、肖秀丽[23]的试验中均表明，1/2 MS较适合组培苗生根。本试验采用1/2 MS为基本培养基，分别添加不同浓度的NAA和IBA，试验结果表明，IBA比NAA诱导生根的效果更好，这与周婷[3]、K. Waseem[24]的研究结果相同。

参考文献

[1] Oberfield S E， Witchel S. “In vitro” multiplication of chrysanthemum morifolium ramat[J]. Hormone Research in Paediatrics， 2005，51 （2）：
141-147.

[2] 陈芝华. 非洲菊组培苗湿润育苗技术与成本控制研究[D]. 南京：
南京农业大学， 2014.

[3] 周 婷. 出口切花菊‘白扇的引种调查与快繁技术的研究[D]. 福州：
福建农林大学， 2016.

[4] 张天静，雷家军，孙文松. 菊花品种神马的茎段离体快繁研究[J]. 黑龙江农业科学， 2014（12）：
19-22.

[5] 张月娇. 菊花“神马”组织培养快繁技術研究[J]. 林业勘察设计. 2012（1）：
139-142.

[6] 邱美欢， 曲军远， 覃和业， 等. “神马”菊组织培养技术研究[J]. 热带农业科学， 2008， 28（1）：
30-31.

[7] 张 燕，王志勇. 菊花组织培养技术研究进展[J]. 廊坊师范学院学报（自然科学版）， 2015，15（4）：
80-85.

[8] 王自布， 莫国秀， 罗会兰， 等. 菊花不同外植体组培快繁及其再生体系的研究[J]. 北方园艺， 2015（18）：
106-109.

[9] 袁成志， 李 波， 杨蔚然. 菊花组织培养技术研究[J]. 北方园艺， 2010（16）：
154-156.

[10] 肖志坚， 纪 艳， 刘德江， 等. 菊花的组织培养技术[J]. 园艺与种苗， 2012（3）：
21-23.

[11] 孙婵娟. 万寿菊的快速繁殖及试管开花研究[D]. 重庆：
西南大学， 2009.

[12] 钟海丰， 余锋锋， 扬 毅， 等. 菊花茎尖克隆体外繁殖研究[J]. 安徽农业科学， 2011， 39（29）：
17 811-17 813.

[13] Karim Mz A M A Z， Oberfield S E. Rapid multiplication of Chrysanthemum morifolium through in vitro culture[J]. 2003.

[14] 张家瑛. 贡菊离体快繁体系优化及种苗分级标准研究[D]. 广州：
广州中医药大学， 2016.

[15] 陈兵先， 黄宝灵， 吕成群， 等. 植物组织培养试管苗玻璃化现象研究进展[J]. 林业科技开发， 2011， 25（1）：
1-5.

[16] 蔡祖国， 徐小彪， 周会萍. 植物组织培养中的玻璃化现象及其预防[J]. 生物技术通讯， 2005， 16（3）：
353-355.

[17] 徐清燏. 5个重要菊花品种高效不定芽再生体系的研究[D]. 北京：
北京林业大学， 2005.

[18] 蒋细旺， 刘国锋， 包满珠. 菊花9个品种叶片和茎段快速高效再生体系的建立[J]. 华中农业大学学报. 2003（2）：
162-166.

[19] 张艳利. 金盏菊叶柄组织培养技术初探[J]. 现代农业. 2016（2）：
95-96.

[20] 陈雪鹃， 吴 珏， 李雪珂， 等. 芙蓉菊组培快繁技术的研究[J]. 中南林业科技大学学报， 2012， 32（7）：
100-104， 127， 封3.

[21] 李露华. 贡菊种苗离体快繁与复壮技术的研究[D]. 广州：
广州中医药大学， 2015.

[22] 王丽华. 银胶菊组培技术及玻璃化防止措施研究[D]. 雅安：
四川农业大学， 2005.

[23] 肖秀丽. 出口专用型切花菊离体快繁及生产应用技术研究[D]. 泰安：
山东农业大学， 2005.

[24] Waseem K，Jilani M S，Khan M S. Rapid plant regeneration of chrysanthemum （Chrysanthemum morifolium I.） through shoot tip culture[J]. African Journal of Biotechnology，2009，8（9）：
1 871-1 877.