猪传染性胃肠炎诊断技术研究进展

孙伟　刘杉杉　周佳　黄雪飞　吴强

摘要：猪传染性胃肠炎在全世界范围内暴发，临床症状主要以仔猪腹泻、呕吐和脱水为主，严重者可导致死亡，给生猪养殖造成了巨大的经济损失。随着混合感染加剧，特别是与TGE类似病症的传染病的出现，单纯依靠临床观察和病理变化，很难对该病做出准确诊断，因此需要借助于免疫学和分子生物学检测技术。本文就免疫学和分子生物学技术在TGE诊断中的最新应用情况进行综述，以期为TGE的防控提供一定的科学参考。

关键词：猪传染性胃肠炎;免疫学;分子生物学;诊断技术;研究进展

猪传染性胃肠炎（transmissible gastroenteritis，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）感染引起的一种高度接触性烈性传染病。TGEV与猪群高发病率密切相关，临床症状主要以腹泻、呕吐和脱水为主。不同年龄和品种的猪群均易感，其中2周龄以内仔猪感染TGEV后，可出现严重腹泻，病死率高达100%[1]。1933年美国首次出现TGE，并在1946年由Doyle和Hutchingd首次分离并鉴定第一株TGEV[2]。随后，TGE相继出现在日本、英国等欧洲、北美洲和亚洲等多个国家和地区。我国自上世纪60年代首次发病以来，TGE不断在我国大部分地区流行，并呈现逐年上升的趋势。TGEV给全世界的养猪业造成了巨大的经济损失。本文就TGE的诊断技术和研究现状做如下综述，以期为TGE的有效预防和研究提供科学参考。

1病原特征

TGEV是一种有囊膜的、单股正链RNA病毒，分类学上属于冠状病毒科a冠状病毒属成员。病毒粒子呈圆形或椭圆形，直径约为100_150nm[3]。TGEV基因组全长28.6kb，共编码4种结构蛋白和3种非结构蛋白[4]。

TGEV对外界的抵抗力较强，20℃存放2周或是35℃存放24h，仍具有感染性。粪尿和肠道组织中的病毒粒子，在低温下保存数月，滴度仍无明显改变。但TGEV对光和紫外线敏感，经照射后很快失活。乙醚、氯仿、甲醛、去氧胆酸钠等有机溶剂作用后很快失活。

2诊断技术研究

TGE是一种高度接触性传染病，易和猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PED）、猪A群轮状病毒（porcine A group rotavirus，PGAR）混合感染，且三者临床症状、传播途径类似，很难区分。因此，快速诊断对于TGE的有效防控具有十分重要的意义。然而，目前很难对TGE做出临床确诊，仍需要借助于分子生物学或是免疫学方法，才能做出最终的鉴别诊断。

2.1免疫学诊断技术

2.1.1酶联免疫吸附测定

酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测方法敏感性高、特异性强，且操作简单，可同时对大量样本进行病原和血清抗体检测。宋振辉等[5]通过原核系统表达的TGEV衣壳蛋白为抗原，建立了一种检测TGE的间接ELISA方法，相比于商品化的抗体检测试剂盒，特异性、敏感性和符合率分别达到了93.8%、93.5%和93.5%。屈月等[6]在此基础上进行了改进，建立了由TGEVN蛋白单克隆抗体和多克隆抗体构成的夹心ELISA方法。結果表明，该方法具有良好的重复性，与其他病原体无交叉反应。同样，原核表达TGEVS基因主要的抗原位点序列，并通过该重组蛋白建立的间接ELISA方法与TGEV包被的ELISA方法相比较，检测结果符合率也高达90%以上。尹杰等[7]基于编码S基因的B、C抗原位点，建立的间接ELISA方法特异性和重复性均较好，且敏感性远高于血清中和试验，有望应用于TGEV的检疫和进行流行病学调查。郭宏伟等[8]对N蛋白进行了表达，建立了可检测TGEV血清抗体的间接ELISA方法，通过与中和试验比较，符合率为100%，且检测假阳性和假阴性率低。

2.1.2病毒中和试验

S蛋白突出于TGEV病毒粒子表面，是唯一能够诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白。然而研究发现，TGEV与猪呼吸道冠状病毒（porcine respiratory coronavirus，PRCV）序列存在高度的相似度，利用中和试验检测TGEV抗体时两者之间存在交叉反应，降低了诊断的特异性，因此限制了中和试验在TGE诊断的应用。

2.1.3胶体金技术

胶体金免疫层析技术具有操作简单、灵敏度高、诊断结果直观等优点，目前已经广泛应用于细菌、病毒和寄生虫等动物性疾病诊断。常亮等[9]利用柠檬酸纳还原法制备的胶体金试纸条，可特异性检测出低至150μg/mL的TGEV，该试纸条可在常温下保存1年之久，有望用于生产实际。李嘉琛[10]等研发了一种可标记TGEV单抗的胶体金颗粒，将其包被在玻璃纤维膜上，并分别以羊抗鼠lgG和TGEV单抗为质控线和检测线。结果显示，该试纸条检测灵敏度为102TCID50/O.1mL，且与RT-PCR检测结果和进口试纸卡吻合。

2.2分子生物学诊断技术

2.2.1RT-PCR技术

PCR技术自出现以来，广泛应用于分子生物学领域。RT-PCR是指以mRNA为模板，进行PCR扩增的技术。早在1997年，Pa-ton等[11]建立了一种基于S基因序列，检测TGEV的RT-PCR方法，可用于与PRCV鉴别诊断。通过对临床样品进行检测，发现RT-PCR敏感性优于传统的病毒分离和ELISA检测手段。Dong等[12]坷针对N基因保守区建立了RT-PCR检测方法，通过对临床样品检测发现，特异性和重复性100倍优于普通PCR。王黎等[13]针对N基因保守序列建立的RT-PCR方法，完成了几百份临床样品的检测，灵敏度高达1Opg。

2.2.2巢式RT-PCR （RT-nPCR）技术

巢式PCR是一种变异的聚合酶链式反应，通过采用两对特异性引物对目的基因进行扩增，大大提高了反应的敏感性和特异性。20世纪80年代以来，出现了一种新的名为PRCV的TGEV变异毒株。与TGEV相比较，仅在S基因的5端672位和681位之间出现了缺失。美国学者Kim[14]基于S基因缺失片段，首次建立了可用于PEDV和PRCV鉴别诊断的RT-nPCR技术，可直接对粪便样品进行检测。随后，Jung等[15]建立了一种新的双重RT-nPCR技术，可同时检测出组织病理切片中PEDV和TGEV，与原位杂交技术相比较，吻合率为100%。Salem等”[16]进一步建立了多重RT-nPCR，可同时检测出发生腹泻的样品中PEDV、TGEV和PRV感染情况。该方法可检测到的TGEV下限浓度为102TCID50/mL。Rodrl guez等[17]通过对TGEV高度保守区设计引物，建立了可用于检测组织培养和临床样品中TGEV含量的RT-nPCR，有助于对猪场TGEV做出诊断。

2.2.3双重或是多重RT-PCR

双重或多重RT-PCR可通过在检测体系中加入1对以上的特异性引物，从而实现对两种以上病原微生物检测的目的，该方法在混合感染样品检测中显得尤为重要。TGEV常和PEDV、PGAR混合感染，且临床症状、病理变化和流行病学极为相似，因此需要借助实验室检测技术才可以做出确诊。

早在2007年，Kim等[14]就建立了同时可以检测和定量PEDV和TGEV的多重RT-PCR法。人为感染试验结果显示，腹泻刚一出现便可采用该方法检测到PEDV和TGEV。张坤等[15]根据PEDVM基因、TGEVN基因、PGARVP7基因建立的多重PCR可检测到最低35pg限量的三联疫苗混合RNA。通过对75份猪粪便样品进行检测分析，与常规RT-PCR相比较，该技术特异性强、敏感度高，可用于检测腹泻样品中的PEDV、TGEV和PGAR。我国学者陈芳等[19]为了对TGE和PED混合感染做出准确的鉴别诊断，建立了同时可检测这两种病原体的双重PCR方法，结果表明可检测出lOpg TGEV RNA和lOOpg PEDV RNA。闫若潜等[20]也建立了特异性较好的PEDV和TGEV二重PCR检测方法，可检测到lOTCID50/mL的病毒含量。

2.2.4荧光定量PCR（qRT-PCR）技术

qRT-PCR技术具有灵敏度高、可实时定量的特点，已经广泛用于分子生物学和医学检测，对于疾病的高通量检测具有明显的优势。2007年，Bai等[21]建立的基于TaqMan探针的qRT-PCR方法，可检测15.3拷贝/μL的质粒DNA，远高于普通PCRl.53x103拷贝/μL的检测极限，且具有良好的重复性和特异性。Vemula-palli等[22]通过对TGEV的S基因进行序列比对，设计出特异性引物并引入绿色荧光蛋白作为内参，建立的TaqMan荧光定量RT-PCR技术，可用于粪便样品检测，灵敏度可达2.8个拷贝，且能与其他种猪呼吸道病毒冠状病毒鉴别诊断。龚双燕等[23]建立的SYBR Green Ⅱ qRT-PCR检测方法可用于提高初乳中TGEV检出率。通过对130份腹泻母猪的初乳进行检测，qRT-PCR可检测出10份阳性样品，而普通PCR仅检测5份，说明建立的荧光定量PCR检测敏感性高，更加适用于病毒微量的样品检测，提高了检出率。侯月娥等[24]建立的双重TaqMan荧光定量一步法qRT-PCR，可同时检测PEDV和TGEV，灵敏度均可达101个拷贝，可快速完成对临床样品的检测。

2.2.5反转录环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（Loop-Media ted lsothermal Amplifi-cation，LAMP）是一种新的核酸扩增方法，其可在等温条件下扩增出DNA/RNA，并具有较高的特异性和灵敏性，且无需特殊的设备，已经广泛用于口蹄疫病毒、流感病毒以及猪水疱病毒等多种RNA病毒的检测。Chen等[25]针对TGEV保守的N基因，设计出6对特异性引物，可检测到1Opg病毒RNA，灵敏度远高于普通PCR。Li等[26]采用3对N基因的特异性引物，通过优化条件后，60℃孵育30min便可以较高灵敏度检测出TGEV，并能与其他病毒进行鉴别诊断。该方法简便易行，适用于TGEV现场诊断。

3小結与展望

TGE在世界范围内广泛流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。因此，对TGE高效、特异性诊断显得尤为重要。目前，对于TGE尚需要借助实验室诊断技术，才能减少诊断的误差，提高诊断的准确性。其中，分子生物学诊断技术具有高效、快捷、准确等优点，在实验室中得到了广泛的应用。RT-nPCR和多重PCR的出现，提高了检测的效率和特异性，特别是qRT-PCR技术的应用大大提高了检测的特异性和灵敏性。但是，受到仪器设备条件的限制，尚无法应用到临床现场诊断。

随着科技的进步，多种便捷式的检测手段问世，有望对猪病现场进行TGE诊断。近几年，胶体金诊断试纸条的出现对于提高临床检测提供了巨大的方便，特别适用于广大基层兽医工作者，这也是今后科学研发的一个重要方向。目前猪病复杂多样，且多为混合感染，这给疾病的鉴别诊断带来了很大的挑战。因此需要综合运用多种检测方法，扬长避短，才能提高检测的灵敏性和特异性，更好服务于我国乃至世界的养猪业发展。

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