纤变灵对口腔粘膜下纤维化大鼠ＥＴ－１表达的影响
时间：2021-05-05 07:52:58 来源：达达文档网 本文已影响 人 
[摘要] 目的研究纤变灵（XBL）对模型大鼠口腔粘膜下纤维化（OSF）内皮素-1(ET-1) 表达的影响。方法将40只大鼠随机分为A（正常对照组）、B（模型对照组）、C（纤变灵组）、D（雷公藤多甙LGTDD组）4组,每组10只， B、C、D组经槟榔提取物（ANE）刺激下制作OSF模型后, B组不作任何处理；C、D组分别以XBL和LGTDD连续灌胃8周。采集口腔颊部粘膜进行ET-1免疫组化检测。结果模型组ET-1的表达明显高于正常对照组(p<0.01)；药物干预后，纤变灵组ET-1表达明显低于模型组和雷公藤多甙组(P<0.01)。结论XBL能够降低ET-1在大鼠OSF组织中的表达，这可能是XBL治疗OSF的机理之一。
关键词：纤变灵 口腔粘膜下纤维化，槟榔提取物 内皮素-1
中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号：1672-5085（2007）6-0054-03
口腔粘膜下纤维化或称口腔粘膜下纤维性变（oral submucous fibrosis, OSF）是一种慢性、隐匿性疾病具有癌变可能的口腔粘膜病，目前普遍认为咀嚼槟榔与OSF发病密切相关，但其发病机理仍不明了。近年来的许多研究证实：某些细胞因子直接参与了OSF的纤维化过程，内皮素-1(ET-1)是迄今所知最强的缩血管因子之一，与组织纤维化密切相关[1]。中医理论认为，血瘀是纤维化疾病的基本病机。我们已研制出以活血化瘀为主的中药复方制剂——纤变灵治疗OSF，临床疗效确切[2]，本研究以槟榔提取物诱导的OSF大鼠为模型，以纤变灵为被试因素，以雷公藤多甙为对照，通过观察该剂对大鼠OSF组织ET-1 表达的影响，探讨其作用机制，为临床治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验药物
槟榔提取物（ANE）：买市售已加工的干槟榔，60℃烤箱烘干碾成粉，称取1.5Kg，加乙醚5L，10%氨水1L，充分混合，强震荡，静置24h，4℃。抽滤去渣后，水浴馏去乙醚及氨，浓缩成膏状，60℃烤箱烤干成粉末状，称取200mg粉溶于20m1蒸馏水，制成10mg/ml浓度， 4℃保存。纤变灵片：由湖南中医药大学第一附属医院药剂科生产提供, 批号：010618。 雷公藤多甙片：福建汇天生物药业有限公司，批号：Z35020431。
1.2 主要试剂和设备
兔抗鼠ET-1(Sigma)； 羊抗兔IgG 、 SABC试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；恒低温切片机 （美国三顿 ）；显微镜（ Olympus）；图像分析系统（Motic公司）。
1.3 实验动物及分组
成年健康雄性sprague-Dawley大鼠40只，体重180～200g,由湖南农业大学实验动物中心提供。随机分为纤变灵组、雷公藤多甙组、模型对照组及正常对照组，每组10只。
1.4 OSF模型制备及给药方法
将大鼠头部套入装有乙醚棉球 的小广口瓶中,待大鼠吸入乙醚麻醉后,用止血钳和镊子张开大鼠口腔,充分暴露颊粘膜,注意在口角伸入颊处有皮肤褶襞与颊粘膜相接,从相接处进针入粘膜下，朝内推进0.5cm后,注入0.2mlANE液,使粘膜凸起呈皮丘样,注射后，再局部表面涂布,之后禁食禁水2hr。 2天一次,连续3个月后,大鼠张口明显受限，颊粘膜苍白,扪之发硬,粘膜下有条索物形成，证明造模成功。造模后，纤变灵组以纤变灵片灌胃，剂量8g/kg（按照体表面积药物剂量换算公式计算，相当70kg成人剂量的2倍）、雷公藤多甙组以30mg/kg雷公藤多甙片灌胃，连续8周，模型组对照组和正常对照组,不作任何干预,直接进行组织制备。
1.5 组织制备及免疫组化染色
到达预定存活时间,大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4ml/kg)深度麻醉,开胸经左心室插管入升主动脉,先以室温生理盐水200--250ml冲洗,继之以4 ℃ 4%多聚甲醛磷酸缓冲液（PF）400ml灌注固定,先快后慢, 取颊粘膜后固定于4%PF中2小时后入30%蔗糖(0.1MPB)浸泡, 待组织沉底后,作冰冻切片,片厚15μm,收集于0.01MPBS中待免疫组化染色，主要步骤如下：370C Triton-H202反应30min, 以3%正常羊血清封闭30min, 加入一抗ET-1，40C 孵育24h，生物素化羊抗兔IgG 60min, ABC液孵育60min后DAB-H2O2 显色，镜下控制反应强度，脱水、透明、封片。阴性对照用PBS代替一抗，排除非特意性染色。
1.6 切片观察与图像分析
Olympus显微镜下观察并照像,用Motic彩色图像分析系统测量口腔粘上皮内免疫阳性细胞的平均灰度值,同时测量切片的背低灰度值，计算其差值,即得出免疫阳性细胞的相对灰度值。
1.7 数据统计分析
各实验数据以均数±标准差（ ±s）表示,用SPSS12.0软件对数据进行分析,多样本平均数比较采用单因素方差分析法,两样本平均数比较,用t检验。
2 结果
如图1所示，正常组（图A）基底层结构清晰，钉突排列规则,固有层结缔组织乳头突向上皮,粘膜下层较厚,ET-1阳性染色极弱； OSF模型组（图B）上皮增生、钉突肥大, ET-1免疫阳性产物密集分布于上皮层细胞、间质及粘膜下层，呈强阳性表达；纤变灵治疗组（图C）ET-1免疫阳性表达明显下降。LGTDD对照组（图D）上皮层细胞及间质ET-1免疫阳性表达有所下降，但粘膜下层阳性染色仍较强。各组相对灰度值见图2。
与A组相比,* P＜0.01;与B组相比,#P＜0.01，※P＜0.05;与D组相比＃P＜0.01。
A：正常组，B：模型对照组，C：纤变灵组，D：雷公藤多甙组
3 讨论
OSF的发病机制至今仍不十分清楚，大量研究表明，OSF的发生与咀嚼槟榔习惯有密切关系。近年来许多研究证实细胞因子与多种纤维化疾病密切相关，是调节细胞的功能如增殖、基质合成的重要介质，这些介质功能的失衡在纤维化疾病中起重要作用。ET-1是日本学者Yanagisawa于1988年首先从猪主动脉内皮细胞培养的上清液分离纯化的血管活性多肽，具有促细胞生长效应，尤其能促进与纤维化有关的细胞增殖、刺激胶原合成增加而与组织纤维化关系密切[3]。有学者研究发现ET-1在口腔粘膜下纤维化中过量表达具有特异性 [4]。本实验研究也证实：大鼠OSF模型组口腔粘膜中上皮细胞ET-1阳性物质含量显著高于正常组（p<0.01），提示ET-1可能作为一种内源性致病因子影响OSF纤维化过程。其原因可推认，ET-1可能以自分泌或旁分泌的方式作用于成纤维细胞，刺激成纤维细胞增殖，诱导胶原合成增加，降低胶原酶活性，直接或间接影响胶原合成及降解代谢，导致组织纤维化。
中医认为本病主要是由于嗜食辛辣燥热之品，温热邪毒郁积局部，引起局部气机不畅，日久气滞血瘀，形成病损；同时应注重机体的自身作用，先天素禀不足，后天失养，邪毒乘虚而入，久病必虚，日久气血失调，肌膜失养则是OSF发病不可忽视的另一重要因素[5]。根据本病气滞血瘀、虚瘀互结的总体病机，我们研制出以活血化瘀为主、兼以扶正祛邪的治疗OSF专用中药复方制剂——纤变灵。可谓药中于病，临床疗效确切。本实验采用纤变灵片对大鼠OSF进行干预治疗结果显示：纤变灵组和雷公藤多甙组分别与模型组比较，其口腔粘膜上皮细胞ET-1免疫阳性相对灰度值的差异均具有统计学意义（p<0.01或p<0.05），而且纤变灵组与雷公藤多甙组比较，其差异也具有显著统计学意义（p<0.01）。其作用机理可能在于纤变灵有效成份能拮抗OSF组织ET-1的分泌，改善上皮微环境，抑制多种促生长细胞因子的分泌，并间接抑制胶原的生成与沉积。从而达到抗纤维化的目的。药理证实[6] ，丹参的有效成份丹参酚酸B盐能阻抑成纤维细胞内ET-1信号转导道路中的蛋白激酶通路的活化，因而通过该途径抑制的胶原基因转录。黄芪含有多糖、苷、黄酮和微量元素，具有多重药理作用，黄芪具有延缓脏器纤维化的能力，延缓发生纤维化的进程。总之，采用活血扶正中药干预治疗大鼠OSF，能通过下调OSF组织ET-1表达并抑制其活性，减轻胶原积聚，这可能是其抗纤维化作用的机制之一。
参考文献
[1] Kikuchi K, Kubo M, Kadono T, et al. Serum concentrations of vascular endothelial growth factor in collagen diseases[J].Br J Dermatol. 1998 Dec;139(6)：1049-51.
[2] 谭劲，陈安，邹丽华等. 纤变灵对口腔粘膜下纤维化及血液流变学的影响[J].医药月刊，2006，3（12）：80～82.
[3] Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells〔J〕.Nature. 1988 Mar 31;332(6163)：411-5
[4] Xu C, Peng X, Liu S, et al. Quantitative and immunohistochemical analysis of endothelin-1 in oral submucous fibrosis〔J〕. Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 2000 Dec;18(6)：394-6,
[5] 谭劲、陈安，活血化纤方治疗口腔粘膜下纤维性变的临床观察[J].中国中医药信息杂志，2001，8（1）：71～72.
[6] 方文贤、宋崇顺、周立孝，医用中药药理学[M].北京人民卫生出版社,1998,899.
*基金项目：湖南省教育厅基金项目（No. 01C238）,湖南省中医药管理局基金项目（No.2000033）。
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文”
