RP—HPLC法同时测定胆石消胶囊中四种蒽醌类成分的含量

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[摘要]目的 建立以RP-HPLC法同时测定胆石消胶囊中大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量测定方法。方法 采用Waters SunFire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-0.1%磷酸（85∶15）为流动相，流速：1.0 ml/min，柱温：28℃，检测波长：254 nm。结果 大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚进样量分别在0.132 08～0.792 48 μg、0.087 52～0.525 12 μg、0.111 84～0.671 04 μg、0.080 16～0.480 96 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，相关系数分别为0.9998、0.9996、0.9994、0.9997，平均加样回收率分别为99.32%、98.80%、99.05%、99.14%，RSD分别为0.76%（n=9）、1.31%（n=9）、1.41%（n=9）、0.94%（n=9）。结论 本方法简便易行，专属性强，准确度高，重现性好，可作为胆石消胶囊质量控制方法。

[关键词]反向高效液相色谱法；胆石消胶囊；大黄酸；大黄素；大黄酚；大黄素甲醚

[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）07（c）-0004-04

[Abstract]Objective To establish the content determination method of rhein，emodin，chrysophanol and physcion in Danshixiao capsules via RP-HPLC method.Methods Waters SunFire C18 column （250 mm×4.6 mm，5 μm） was adopted，and methanol-0.1% phosphate （85∶15） was selected as mobile phase，with flow rate：1.0 ml/min，column temperature：28℃，and determination wavelength：254 nm.Results Sample size of rhein，emodin，chrysophanol and physcion was within the range of 0.132 08-0.792 48 μg，0.087 52-0.525 12 μg，0.111 84-0.671 04 μg，and 0.080 16-0.480 96 μg respectively，which showed favorable linear relations with peak areas.The correlation coefficient was 0.9998，0.9996，0.9994 and 0.9997 respectively，the average recovery rate was 99.32%，98.80%，99.05%，99.14% respectively，and RSD was 0.76% （n=9），1.31% （n=9），1.41% （n =90），0.94% （n =9） respectively.Conclusion The method is easy to operate，with high specificity，high accuracy and good reproducibility，which is able to be taken as the quality control method of Danshixiao capsules.

[Key words]Reversed phase high-performance liquid chromatography；Danshixiao capsules；Rhein；Emodin； Chrysophanol；Physcion

胆石消胶囊为医院制剂，处方中含有大黄、茵陈、金钱草、黄芩等中药材，具有清热利湿、利胆排石的功效，临床用于胆道结石、胆道感染以及胆囊炎等，疗效显著。大黄是本方中君药，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的功效。大黄的主要化学成分为蒽醌类化合物，现代药理研究表明，大黄作用的物质基础也主要是蒽醌类化合物，大黄中的蒽醌类成分能够疏通毛细胆管，促进胆汁分泌，改善胆小管内胆汁淤积，增加胆红素排出；大黄还能促进胆囊收缩，松弛奥狄氏扩约肌，增加胆汁排出量。体外实验表明，大黄中含有的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素对多种致病菌均有抑制作用。此外，大黄还有一定的抗炎作用[1]。本文参考《中国药典》2015年版一部及有关文献资料[2-13]，建立了同时测定胆石消胶囊中大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚四种蒽醌类化合物含量的RP-HPLC法，为提高胆石消胶囊的质量标准提供研究基础，为其他含大黄制剂中蒽醌类成分的含量测定提供参考。

1材料与方法

1.1主要仪器

Waters2695高效液相色谱仪，2998 PDA检测器，Empower 3色谱工作站；CBL9960A超声波清洗器（上海科导超声仪有限公司）。

1.2主要试剂

对照品：大黄酸（批号：110757-201306）、大黄素（批号：110757-2013110）、大黄酚（批号： 110796-20135）、大黄素甲醚（批号；110758-201310），均购自中国药品生物制品检定所；胆石消胶囊（批号为150214、150215、150216）；阴性样品系按胆石消胶囊处方工艺制备不含大黄的供试品；磷酸、甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.3实验方法

1.3.1色谱条件

色谱柱：Waters SunFire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸（85∶15）；流速：1.0 ml/min；柱温：28℃；检测波长：254 nm；进样量：10 μl。理论塔板数以大黄素峰计算应不低于4000。

1.3.2溶液制备

1.3.2.1对照品溶液的制备 精密称取大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚四种对照品分别为16.51、10.94、13.98、10.02 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇，超声处理10 min（功率200 W，频率40 kHz）使之溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得每1毫升含大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分别为0.3302、0.2188、0.2796、0.2004 mg的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液1.00 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得每1毫升含大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分别为0.066 04、0.043 76、0.055 92、0.040 08 mg的混合对照品溶液。

1.3.2.2供试品溶液的制备 取胆石消胶囊内容物粉末约4.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（10∶1）混合溶液25 ml，85℃加热回流1 h后放冷，转移至50 ml量瓶中，用少量甲醇洗涤容器，洗涤液并入50 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即制得供试品溶液。

1.3.2.3阴性对照溶液的制备 按胆石消胶囊处方工艺，取除大黄以外的其他中药饮片，按“1.3.2.2”项下方法操作，制得不含大黄的阴性对照溶液。

1.3.3方法学考察

1.3.3.1系统适用性考察 分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定分析。

1.3.3.2线性关系考察 按“1.3.1”项下色谱条件，分别精密吸取混合对照品溶液2、4、6、8、10、12 μl注入色谱仪，记录峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），质量数（μg）为横坐标（X），进行回归方程计算，考察线性关系。

1.3.3.3重复性考察 取批号为150216的胆石消胶囊内容物，按“1.3.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，分别进样，记录峰面积，计算大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量。

1.3.3.4精密度考察 取混合对照品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件，重复进样6次，每次10 μl，分别计算大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚色谱峰面积的RSD值。

1.3.3.5稳定性考察 取重复性考察中供试品溶液1份，分别于0、4、8、16、32 h进样测定，记录峰面积，分别计算大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚色谱峰面积的RSD值。

1.3.3.6加样回收率试验 取已知含量的批号为150214的胆石消胶囊内容物粉末9份，每份2.0 g，精密称定，分别加入混合对照品储备液2、4、6 ml，按“2.2.2”项下制备方法制得供试品溶液，每个浓度6份，进样测定，记录峰面积。

2结果

2.1系统适用性考察

由图1可知，理论塔板数按大黄素计算不低于4000；四种成分各自与相邻峰之间分离度均大于1.5；阴性对照溶液色谱图中，大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚在与对照品相同的保留时间处未出现色谱峰，说明样品中其他成分对上述四个成分无干扰。

2.2线性关系考察

结果表明，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的线性回归方程分别为 Y=3.3581×105X-8.0351×104（r=0.9998）；Y=2.5907×105X-8.2471×104（r=0.9996）；Y=3.0452×105X-2.1198×104（r=0.9994）；Y=1.7597×105X-4.0635×104（r=0.9997）。大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚进样量分别在0.132 08～0.792 48 μg、0.087 52～0.525 12 μg、0.111 84～0.671 04 μg、0.080 16～0.480 96 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3重复性考察

结果表明，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为0.6060、0.3980、0.8810、0.2806 mg/粒，RSD分别为0.9%、1.2%、0.2%和0.8%，说明本方法具有良好的重复性。

2.4精密度考察

结果表明，大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚色谱峰面积的RSD分别为0.9%、1.5%、1.7%和0.5%，说明精密度良好。

2.5稳定性考察

结果表明，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚色谱峰面积的RSD分别为1.8%、1.2%、0.5%和0.9%，说明供试品溶液在32 h内稳定。

2.6加样回收率试验

从表1可以看出，大黄酸、大黄素、大黄酚、和大黄素甲醚的平均回收率分别为99.32%（RSD=0.76%）、98.80%（RSD=1.31%）、99.05%（RSD=1.41%）、99.14%（RSD=0.94%）。

2.7样品测定结果

按“1.3.2.2”项下方法制备三批胆石消胶囊供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，记录峰面积，按外标法计算三批样品中大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。结果表明，三批胆石消胶囊中大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量稳定（表2），本方法适用于胆石消胶囊质量控制方法。

3讨论

《中国药典》2015年版一部中，大黄药材中总蒽醌含量测定采用先甲醇加热回流后盐酸水解，三氯甲烷回流提取、萃取的方法制备供试品溶液，时间较长，操作步骤多，目标成分容易损耗。本试验则采用甲醇-盐酸（10∶1）混合溶液加热回流同时水解的方法，提取时间较短，操作简单，过程容易控制。本实验前期还对水解温度（70、85、100℃）、提取时间（30、60、90 min）进行了考察，结果以85℃为最佳水解温度，在此条件下加热提取60 min即可提取完全。

在配制混合对照品溶液过程中，发现大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚四种对照品在甲醇中的溶解性不够理想，在制备混合对照品储备液时，由于配制浓度较高，对照品不容易溶解，需要超声10 min，对照品才能完全溶解。如果在制备混合对照品储备液时不予超声辅助溶解，就有可能因对照品未充分溶解而导致检测结果偏离。

本实验前期还进行了色谱柱的耐用性考察，选择了6种色谱柱（SunFire C18、Kromasil C18、InertSustain C18、Zorbax TC-C18、SymmetryC18、Shima-Pack VP-ODS）进行测定，其中Symmetry C18、Shima-Pack VP-ODS两种色谱柱大黄酸与杂质峰不能达到有效分离，在使用Symmetry C18过程中，发现其柱效较高，目标峰与杂质峰完全重合，但是纯度分析显示目标峰为不纯峰，含有杂质。大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚属于弱酸性化合物，不同选择性的C18柱得到了差异性的色谱分离结果，这可能与大黄中蒽醌类成分含有多个酚羟基，在酸性流动相条件下易于与C18柱残留较多的硅羟基或者色谱柱内嵌的极性基团（如酰胺基）相互作用有关。本实验提示，高柱效等于高分离，柱效高的色谱柱不能保证其具备好的分离效果，尤其是弱酸性、弱碱性物质的分离效果，C18柱的类型选择尤为重要[14-15]。

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（收稿日期：2016-05-05 本文编辑：卫 轲）